あなたに最適な光散乱検出器はどれですか？
どのゲル浸透/サイズ排除クロマトグラフィー (GPC/SEC) システムがあなたのニーズに最適か決定することは、大変な作業である可能性があります。絶対分子量データを取得するために光散乱検出器を導入することを決定した後でも、多角度光散乱 (MALS) 検出器と直角および低角度光散乱検出器 (RALS/LALS) のどちらかを選択する必要があります。どちらの光散乱設定も試料の絶対分子量を提供しますが、同じ目標に向かって異なるアプローチを利用します。幸い、Malvern Panalytical はどちらも提供しており、SEC-MALS 20 モジュラーユニットは OMNISEC、TDAmax、または他の第三者システムに接続でき、統合されたRALS/LALS検出器はOMNISECおよびTDAmaxのオールインクルーシブGPC/SECシステムに組み込まれています。この投稿では、MALSおよびRALS/LALS検出器について説明し、あなたのアプリケーションに最適な設定を決定するために必要な関連情報を提供できればと思います。
最初に、少し立ち止まり、光散乱理論について簡単に説明します（静的光散乱についての詳細な議論については、以前に発表したホワイトペーパーをご覧ください）。光散乱検出器が機能する理由は、分子が散乱する光の強度がその分子量に直接比例するからです。分子量が高いほど、散乱された光の強度は高くなります。この関係は、以下に示すレイリー方程式によって強調されており、RΘは特定の角度Θでの散乱光の強度、Mwは試料の分子量を表します。
さらに、散乱光の観測角度も影響します。半径が10–15 nm以下の比較的小さい試料は等方性散乱体として知られており、すべての方向に同じように光を散乱することを意味します。これは、90°の検出器で観測される光の強度が、15°、45°、135°などに配置された検出器で観測される強度と同じであることを意味します。その10–15 nmの範囲よりも大きな試料は干渉の影響を受け、試料が十分に大きく、検出器に到達する前に光を複数回散乱することが可能です。その結果、大きな試料の散乱光の強度は観測角度に依存して変化します。散乱光の強度の角度依存性は、検出器の配置に基づいて異なる分子量が計算される可能性があることを意味します。干渉の影響を最小限に抑えるために、大きな試料からの散乱光の強度に適した観測角度は0°です。実用的な視点からは、検出器が試料からの散乱光と入射ビームの光を区別することができなくなるため、これは不可能です。0°の角度で散乱光の強度を観測することの解決策は、MALSおよびRALS/LALS検出器の設定によって表されます。
MALS検出器は通常、試料フローセルの周りに様々な角度で配置された3つから20以上の検出器を使用します。90°の検出器が通常含まれ、残りの検出器は12°から168°までの範囲に配置されます。MALS検出器は様々な角度で散乱光の測定を行い、データをモデルに当てはめ、0°に外挿して試料の分子量を決定します。試料が等方性散乱体である場合、各データポイントは同じ散乱強度を表し、0°への外挿は平らな線になります。試料が角度依存性を示すのに十分大きい場合は、観察角度に基づく散乱光強度の違いが明らかになります。両方の例は、以下の部分的なジムプロットに示されています。
MALS応答のさまざまな角度を示す部分的なジムプロット；左：すべての角度で同じ強度を示す等方性散乱を示す試料；右：プロットの傾斜によって証明される角度依存性を示す試料
RALS/LALS検出器配置は、90°および7°の検出器で構成され、補完的な性質のために慎重に選択されています。半径が10–15 nmの試料およびそれより小さい試料には、90°の検出器が理想的です。これは入射ビームに対して直角に配置されており、信号対雑音比を最大化します。小さな試料はすべての方向で同じ強度で光を散乱するため、RALS検出器は試料の分子量を直接測定するのに最適な応答を提供します。10–15 nmを超える半径を持ち、角度依存性を示す試料では、LALS検出器が7°で測定を行います。これは利用可能な最低の検出器位置です。7°の配置は、検出器が試料の分子量を直接測定しているのと実質的に同等であり、当てはめや外挿の必要性を回避します。LALS検出器はすべてのサイズの試料に対して正確ですが、散乱光の強度が低い小さな、低分子量の試料では、RALSが入射光源に対して直交しているため、よりクリーンな信号を提供します。
分子量の直接測定を示す部分的なジムプロット；左：等方的散乱を示す試料の測定のための90° RALS応答；右：角度依存性を示す試料の測定のための7° LALS応答
あなたのニーズに最適な光散乱検出器を決定するために、アプリケーションや求めている情報、個人の好みを考慮する必要があります。MALSおよびRALS/LALS検出器はどちらも特定の状況により適した利点と欠点を持っていますが、どちらも正確な結果を提供すると信頼できます！
例えば、主要な分析対象が高分子量の比較的大きな試料である場合、MALSおよびRALS/LALS検出器の構成は試料に存在するすべての分子量範囲を扱うように設計されています。しかし、小さく、低分子量の材料を主に分析したい場合、RALS検出器はあなたの分析の大部分を処理できるでしょう。補完的なLALS検出器があれば、試料内に存在する可能性のある凝集体や低濃度で存在する大きな分画を正確に観察できるでしょう。MALS検出器は正確な分子量を決定できるが、小さく等方的な散乱を示す試料に対して、全ての検出器が同じ強度の散乱光を観測するため、同じ結果を何度も得ることが繰り返される可能性がある。
上記の例は、タンパク質を研究する科学者にはよくあることです。構造が規則的であるため、タンパク質は比較的密度の高い分子であり、高分子量の種であっても相対的に小さいことを意味します。分子量が高い可能性があるが比較的小さい分子サイズを持つことが、タンパク質が典型的に等方性散乱体であり、RALS/LALS検出器の理想的な試料であることを示しています。この場合、RALS検出器が計算に使用される主な検出器であり、LALS検出器がサンプル内の凝集体またはより大きな成分を検出します。タンパク質が一般的に等方性散乱体であるため、MALS検出器に含まれるさまざまな角度の多くの検出器を持つことには追加の利点はありません。
この点を説明するために、一連のタンパク質の分子量がRALSおよびMALS検出器の両方を使用して測定されました。結果として得られたデータが下の図に示されており、どちらの検出器からも同じ分子量が得られることが明らかです。これは、等方性散乱を示す試料に対して、RALS検出器がMALS検出器と同じ結果を提供することを確認します。
RALSおよびMALS検出器を使用して計算されたタンパク質の分子量；分子量（kDa）
もし分子量だけでなく分子サイズにも興味がある場合、MALS検出器は試料の回転半径（Rg）を計算する能力を提供します。ただし、注意点があります：これは10–15 nmを超える半径を持つ試料のみで可能であり、部分的なジムプロットの角度依存性によって生成された傾きからRgが計算されます。試料が等方性散乱体である場合、傾きはなく、Rgを決定することはできません。ちなみに、サンプルのヒドロダイナミック半径（Rh）は、粘度計データの固有粘度（IV）データと光散乱検出器で得られた分子量データを組み合わせることで数nmまで決定することができます。
それに加えて、アプリケーションに特有の実用的な項目を考慮することがあるかもしれません。特にUPLCアプリケーションの場合、UPLCアプリケーション 用に複数の検出器を統合する場合、RALS/LALS検出器内の小さなフローセルが有益かもしれません。また、光散乱セルの汚染に悩まされている場合、特定のセルの向き（例：SEC-MALS 20 の垂直フローセル）を選択することで、追加の頑丈さと信頼性を提供することができます。
もちろん、個人の好みは光散乱検出器を選ぶ際の要因です。もしかしたら、あなたは常にMALS検出器を使用していて、特定の外挿モデルを使って分子量を計算することに慣れているかもしれません。あるいは、分子量を計算するためのRALS/LALSのアプローチの簡単さと直接性を好むかもしれません。または、予算内で作業しており、機器の価値を最大化したいと考えているかもしれません。
最後の項目について、すべての人が関連することだからこそ、少しコメントしたいです。これらの検出器ユニットのコストは、個々の光散乱検出器の数に応じて規模が変わります。RALS/LALSの構成では2つの検出器があり、SEC-MALS 20では20があります。価格はそれに応じて異なります。MALS検出器で利用可能な角度範囲があることには実質的なデメリットはありませんが、等方性散乱体に関しては、追加の角度が必ずしも追加の情報を提供するわけではありません。
そして、最もコスト効率の良い方法ではありませんが、同じシステムにMALSとRALS/LALSの両方の検出器を配置し、データを同時に収集し、データ分析中に計算に使用する検出器を選択することもできます。
私がこの投稿で十分な情報を提供し、MALSまたはRALS/LALS検出器（または両方）があなたの用途に最適かどうか決定する手助けができればと思います。どちらを選んでも、私たちはあなたをサポートします！
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