粗反応混合物のスクリーニング

はじめに

フラグメントスクリーニングは、創薬プロセスでの初期ヒット化合物を特定する強力なアプローチとして登場しました。主要な特長として、少数(1000s)の低分子量(通常250 Da未満)化合物をスクリーニングして、標的と結合できることが挙げられます。微小な化合物ほど結合する可能性が高くなり、親和性は低くなりますが、Creoptixセンサを含む多くの異なる生物物理的アプローチを使用できます。多くの標的上のほとんどの結合部位に結合しているフラグメントを特定することは、比較的容易です。課題は、薬剤特性の最適化を開始する前に、フラグメントをより大きなヒット化合物に成長させて、より高い親和性を持たせるようにする必要があることです。

標的(リガンド、L)と結合する化合物(検体、A)の親和性が、以下のように単純な平衡状態であると仮定します。

この場合、k_dは解離またはオフレートになり、k_aは結合またはオンレートになり、平衡解離定数または親和性(K_D)は比率_d / k_aになります。多くの場合、化合物の変更によりオフレートが遅くなると、親和性が向上します。これは一次速度定数のため、濃度に依存しません。

従来の最適化アプローチでは、個々の反応に基づいて各化合物を合成し、定義された濃度で化合物を精製し、構成してから、アッセイで親和性を測定する必要がありました。Vernalisは、粗反応混合物（CRM）をスクリーニングするアプローチを開発しました。これにより、合成の速度とコストが劇的に改善され、化合物の親和性を向上させる機会を検討することができます。ヒット化合物の場合、一連の反応は通常、プレートベース形式で、並列で実行され、ヒット化合物に組み込まれた置換基が変更されます。最小限の作業を行った後、最終的な粗反応混合物を個別に評価して、標的との結合のオフレートの変化を確認します。オフレートの変化は、親和性が向上した化合物が得られたことを示します。このようなオフレートスクリーニング(ORS) ¹の最初のデモンストレーションでは、Biacore技術を使用することで、材料、関連する廃棄物処理、時間の点で効率性が向上しました。また、構造活性相関(SAR)をしっかりと把握していない初期段階で、プロジェクトのより多くの化合物の迅速なランク付けが可能になりました。

オフレートの変化を確実に検出する機能は、このアプローチの鍵となります。独自の高感度のグレーティング結合干渉法(GCI)技術は、Surface Plasmon Resonance (SPR)などの従来の技術よりも優れた感度を提供し、最大10s^-1のオフレートを測定できます。さらに、Creoptix WAVEの非凝固マイクロ流体により、アセトニトリルや高濃度のDMSOなどのさまざまな溶媒を使用できるため、粗反応混合物に使用できる化学的性質の範囲が拡大します。

このテクニカルノートでは、2つの標的であるPyruvate Dehydrogenase Kinase 2 (aa16-407) (以後、「PDHK2」とする) とHeat Shock Protein 90 α (aa9-236)のN末端ATPaseドメイン(以後、「Hsp90」とする)に対して、同じCRMライブラリを遡及的に使用し、Creoptix WAVEで取得したORSの結果とBiacore装置を使用して、Vernalisから事前に取得した結果と比較しています。Vernalisは従来、GHKLファミリーのATPasesの両方のメンバーに対して、一連の強力な阻害薬を同定していました。^2、3、4

材料と方法

粗反応混合物(CRM)のオフレートスクリーニング。WAVEdeltaでは、83のCRMと精製制御化合物をオフレートでスクリーニングしました。PCH-NTA WAVEchipには、標的タンパク質を捕捉する前に塩化ニッケルを装填しました。その後、7000 pg/mm²で、チャネル2とチャネル3それぞれに、二重His6タグ付きHSP90タンパク質および二重His6タグ付きPDHK2タンパク質が捕捉されました。チャネル1および4はニッケル負荷で、参照チャネルとして使用されました。CRMは、HBS-P + 1% DMSOで約20 μMの濃度で30秒間、250 μl/分の一定流量で注入されました。解離は120秒間実行されました。オフレートの決定は、WAVEcontrolソフトウェアを使用して実行されました。

精製化合物反応速度

PCH-NTA WAVEchipには、タンパク質の捕捉前に0.5 mMのNiCl²が装填されました。HSP90とPDHK2は、密度ca. 3500 pg/mm2のHBS-P緩衝液で捕捉されました。VER235377 (精製化合物)は、27.4 Nm～20 μM (7つの濃度、3倍希釈)で濃度を上げながら、HBS-P + 1% DMSOで30 μl/分注入されました。60秒間の解離フェーズの前に60秒間注入が行われました。すべての相互作用解析を25°Cで実行し、WAVEcontrolを使用してデータを評価しました。データフィッティングにLangmuir 1:1モデルを使用して、動態パラメータを決定しました。

結果

Vernalisは、オフレートスクリーニング(ORS)を使用して、ヒットツーリードの化学的環境において、動力学的なサンプル作成を開発したパイオニアです。¹ 化学情報学、化合物ライブラリ合成、およびSurface Plasmon Resonance (SPR)分析におけるVernalisの専門知識は、この基準研究にとって魅力的であり、未精製反応生成物(CRM)のORSを可能にしています。CRMスクリーニングは、化合物ライブラリを精製したり、タンパク質構造を使用したりせずに、フラグメントヒットからリード合物を迅速に同定します。WAVEdelta (GCI技術に基づく)およびBiacore T200 (SPR技術に基づく)を使用して2つの技術を比較することで、ORS比較研究を実施しました。具体的には、選択した化合物をWAVEdeltaで測定し、Vernalisから(Biacore T200で)遡及的にテストしたCRMライブラリと比較しました。 

図1は、選択したCRMのオフレート測定の例を示しています。どちらの実験においても、Creoptix WAVEdeltaから取得した結果は、Biacore T200から取得した結果と一致しました。1s^-1を超えるオフレートの化合物の場合、WAVEdeltaはこれらの極めて高速な解離定数（k_off）を確実に解決することができました。

図1: 選択したCRMのオフレートスクリーン測定は、Biacore T200 (左パネル)またはCreoptix WAVEdelta (右パネル)で実施しました。GCIデータはSPRデータを再生成し、1s^-1よりも高速かつ正確な、信頼性の高い相互作用のオフレート測定を可能にします。

このオフレートスクリーン試験では、WAVEdeltaで精製化合物(VER235377)としても特性評価された、PDHK2選択的ヒットを同定しました。動的パラメータと結合親和性は、SPRベースのBiacore T200で取得した動的パラメータと結合親和性に類似しています。図2は、GCI Creoptix WAVEdelta (右パネル)およびSPR (Biacore T200、左パネル)で取得したデータを示しています。最後に、同じPDHK2選択的ヒット化合物(VER235377) ^2、4を同定しました。取得した動的データを表1に示します。

	Konon (M-1.s-1)	Koffoff (s-1)	Rmax (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1.92x105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1.82x105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6.10x105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3.16x105	0.052	14.5	166

表1: HSP90およびPDHK2を介したT精製化合物VER235377の動的データ

図2: 精製化合物VER235377の結合動的データ測定は、Biacore T200 (左パネル)またはCreoptix WAVEdelta (右パネル)で実施しました。HSP90とPDHK2の両方のタンパク質に関して比較可能なデータを取得しました

つまり、Creoptix WAVEにより、以下が可能になりました。

• Biacore T200 PDHK2 hit ^2、4で事前に報告および測定されたことを確認する
• 同じPDHK2選択的ヒットVER235377を確認し、完全に精製された状態で特性評価する
• HSP90に対するVER235377 PDHK2の選択性を確認する
• 1s^-1を超えるオフレートの化合物に対して優れた分解能を示し、Creoptix WAVEの機能を強調して、高速オフレートを解決する

結論

Creoptix WAVE は、Pyravate Dehydrogenase Kinase 2 (PDHK2)およびHeat Shock Protein 90 (HSP90)に対して遡及的に測定したVernalisの化合物測定の結果で示されるように、Biacore T200の測定値と高度に一致する動的データを提供します。Creoptix Waveは、高感度で超高速な相互作用を解決する能力を備えており、化合物スクリーニングと小分子の反応速度解析を向上させ、医薬品開発を促進し、標的および化合物の精製に関連するコストを大幅に削減します。WAVEは低分子、フラグメント、ペプチドなどの極めて高速なオフレートを示す弱いバインダーのライブラリをスクリーニングする理想的な装置です。また、WAVEを粗分析で未精製の反応混合物の研究を可能にする、非凝固マイクロ流体技術と組み合わせることで、創薬プロセスに革命と高速化をもたらします。

重要事項

Creoptix WAVEsystemを使用することで、粗反応混合物中の弱い結合化合物の高速オフレートを取得できます。

• 粗反応混合物と相溶性をもつ非凝固マイクロ流体が不要で、オフレートスクリーニングおよびフラグメントベースの薬物設計に理想的です。
• SPR履歴データと比較可能なデータGCI技術は、SPRベースの装置で取得されたデータと同様の動的データを提供します
• 1 s^-1を超えるオフレートを適切に解決: 高速移行により、WAVEsystemは最大10 s^-1のオフレートを測定します。

以下の用途に最適です。

• 粗化合物のオフレートスクリーニング: 低分子、フラグメント、ペプチドなど
• 高速なヒットツーリードの進行
• リード分子の最適化

引用文献

1. Murray, J.B. et al.2014.Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance.An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products.J. Med.Chem.57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al.2017.Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J.Med.Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al.2009.Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone.J. Med.Chem.52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L .M. et al.Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures.Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

謝辞

すべての実験を実施したNatalia Matassova博士(Vernalis)、およびRoderick Hubbard教授のテクニカルノートに対する貢献に謝意を表します。