新しいwaveRAPID反応アッセイを使用して、製薬ヒットの発見における限界を押し広げます

概要

数千の化合物の創薬高スループットスクリーニングでは、大量のヒットが発生し、薬剤標的との潜在的な相互作用が示される可能性があります。結合親和性は、多くの高スループットアッセイの定常状態解析から取得できます。さらに開発が可能なヒットを選択するには、結合反応速度の完全な特性評価が必要です。これにより、特に望ましい反応速度の結合率で目的標的に到達する化合物が同定されます。実際には、これは多数のスクリーニングヒット化合物に対して広範な動態研究を実施する必要があることを意味します。これまでは、極めて多くの時間と材料を消費する作業でした。数百のヒット化合物から適切な希釈系列を準備し、各濃度を複製物に注入する必要があります。Creoptixは、このようなプロジェクトをより効率的に行える新しい技術を開発しました。これにより、単一の濃度でサンプルから強力な反応速度特性評価を実行できます。Creoptix WAVEのCreoptix waveRAPIDは、スクリーニング設定における反応速度測定のパラダイム変化を表しています。

現在、当社の顧客であるIdorsia Pharmaceuticals LtdのHTS創薬グループの研究では、多数の薬物ヒット化合物の反応速度特性評価を整理する際に、waveRAPIDが能力を発揮しています。複数の実験において、センサマトリックスに事前に固定された薬剤標的に単一濃度でサンプルをパルス注入することで、最大146個のヒット化合物の結合反応速度がwaveRAPIDによって決定されました。従来のマルチサイクル反応速度測定を使用して、すべての分析化合物が、最新のSPR装置で研究されてきました。 

2つの技術から取得したデータを比較すると、計算された解離定数（K_D）と少数の外れ値との優れた相関が明らかになりました。この研究結果は、初期創薬の応用において、Creoptix WAVEのwaveRAPID技術を検証し、高スループットのスクリーニング設定で、詳細な動的データの生成を可能にします。各化合物の特性評価の時間がわずか数分に短縮されるため、時間と材料を大幅に節約できます。数百種類の結合反応速度を決定するための大規模な測定が、最新のSPR装置と比較して、数週間ではなく数日で実施できます。 

さらに、waveRAPID技術は、アッセイシリーズ全体で複雑な化合物（大きな屈折率の寄与や解離の遅さを示す化合物など）に対しても堅牢なデータを生成しました。このような化合物では、多くの場合、リガンドタンパク質の表面の再生と再固定が必要になります。このため、従来のマルチサイクルアッセイを使用した大規模な測定では、ワークフローが中断されます。Creoptix WAVEに加えて新しいwaveRAPID方法を使用することで、極めて簡単なアッセイ設定が可能になり、サンプルごとに単一の濃度から完全な結合反応速度解析を行うことができます。さらに、統計パラメータの推定値に基づいたCreoptix独自の新しい評価エンジンであるDirect Kineticsは、真の統計誤差計算を含む、自動化された堅牢な分析ワークフローを提供します。waveRAPID技術とDirect Kinetics自動評価エンジンは、現在の初期の創薬における反応速度結合アッセイの実行方法に変革をもたらす強力なパッケージです。

材料と方法

Creoptixプロトコル

ヒスチジンタグ付き標的タンパク質1およびヒスチジンタグ付き標的タンパク質2は、以前にNi²⁺イオンが装填された4PCP-NTA WAVEchip上で、4000～5000 pg/mm²の密度で捕捉されました。10 μMのサンプル溶液から、フローセルあたり32.5 μl/分の流量で化合物のパルス波RAPID注入を25秒間行った後、250秒間緩衝液を注入しました。すべての測定を、0.05% Tween-20および5% DMSOの50 mmのリン酸緩衝液で実施しました。データは、参照チャネルの信号とブランク注入を減算して二重参照されています。6つの注入パルスを介した検出領域内の化合物の見かけ濃度は、化合物サンプルと同じ注入パラメータ、および追加の0.5% DMSOを添加したパルス注入緩衝液を使用してキャリブレーションされました。反応速度解析は、1:1結合モデルを使用してDirect Kinetics評価エンジンにより実行されました。

Biacoreプロトコル

ヒスチジンタグ付き標的タンパク質1およびヒスチジンタグ付き標的タンパク質2は、事前にNi²⁺イオンで活性化されたNi-NTAチップ上で、4000～5000 pg/mm²の密度で捕捉されました。検体は、緩衝液(0.05% Tween-20および5% DMSOの50 mmリン酸緩衝液)中で連続希釈することにより、目的の濃度に調整されました。センサグラムは、結合時間100秒、解離時間250秒、流量40 μl/分で取得されました。結合反応速度(k_on、k_off、およびK_d)を決定するために、二重参照後に取得したセンサグラムは、1:1結合モデルを使用したBiacore T200評価ソフトウェアによって解析されました。

結果

スクリーニングのような設定で反応速度結合データを迅速に取得する新しいwaveRAPID技術が、この研究の最先端の装置と方法論に対して検証されました。図1が示すように、単一の濃度で各サンプルをパルス注入することで、多数のスクリーニングヒット化合物に対して反応速度結合データを迅速に生成できます。検体の解離を含む、各測定時間は約5分です。waveRAPIDによって生成された一般的な応答プロファイルは、図1、パネルA、Bに示されています(データは赤色で表示されており、反応速度1:1モデルは黒で表示されています)。評価されたパラメータは、パネルCのレートマップ(黒色の円内のアッセイ全体に注入された制御化合物)に表示され、優れた再現性を示しています。典型的なアッセイと2つの標的にある384個のサンプルを比較した、標準的なアッセイ時間とサンプルスループットが表1に示されています。 

図1: 薬物ヒットの早期発見と特性評価のために、新しいwaveRAPID技術を使用して、GCIでCreoptix WAVEdeltaを応用します。完全な反応速度特性評価は、waveRAPIDを使用したスクリーニング設定において単一濃度で注入された化合物から取得することができ、早期の薬物ヒット発見で時間とコストを大幅に節約できます。
(a) 80種類の化合物のスクリーニングから、waveRAPID応答プロファイルの代表的な選択を示します。
(b) WAVEcontrolの選択可能なプリセットから、カスタマイズされた注入設定を使用して、すべての親和性に対応できます。ここで、中間バインダーの設定（20秒のパルス注入、250秒の解離）を使用して、低nMから低mMまでの親和性を解決できます。
(c) 運動速度は、対角線で同一の親和性を持つレートマップに表示されます。円内のデータポイントは、アッセイ全体における制御化合物の優れた再現性を示しています。

表1: 典型的なアッセイ実行時間とサンプルスループット: WAVEdeltaのwaveRAPIDと最先端技術（Biacore T200、8k）を比較して、2つのターゲット上の384個のサンプルの全反応速度評価を行いました。

取得した動的データは、結合速度(絶対k_aの100%未満、および絶対k_dの50%未満)のエラーでフィルタリングされ、標準SPRマルチサイクル測定のデータと比較されました。図2に示されているように、従来のSPRマルチサイクル測定と比較すると、2つのデータセット間の相関関係が極めて良好であることがわかります。 

図2: Creoptix WAVEdeltaでwaveRAPIDを使用して測定された薬物スクリーニングヒット結合反応速度は、Biacore T200装置で実行された従来のマルチサイクル反応速度測定値に対してプロットされました。waveRAPIDデータは、結合速度(k_a)が100%未満で、解離速度(k_d)が計算速度パラメータの50%未満の統計誤差に対してフィルタリングされました。相関は、従来の方法と比較して10倍高速の、waveRAPID反応速度法を検証しています。

さらにシステムを検査するために、別の測定を連続で実施しました。この測定では、従来のマルチサイクル測定でワークフローの中断や表面の再生を発生させる、より複雑な化合物がアッセイ全体で実行されました。標的タンパク質との検体の接触時間が大幅に短縮されたことが原因であると推定されますが、これらの複雑な分子(高いバルク応答または解離の遅さを示す)により、WAVEの全体的なワークフローが中断することはなく、断続的な表面再生が不要になることもありませんでした。図3に示すように、ほとんどすべての対象化合物の反応速度結合パラメータは、低誤差で確実に評価することができ、陽性コントロールは引き続き高い再現性を示しています。

図3: 事前に特性評価された30種類の化合物を、高いバルク屈折率(RI)寄与、または解離速度が遅いことを示す30種類のより複雑な化合物、およびアッセイ全体に注入した複雑な化合物アッセイで再度測定しました。複雑な化合物は、従来のマルチサイクル反応速度では大きなワークフロー制限をもたらすため、定期的な表面再生が必要でしたが、waveRAPIDでは、シームレスなワークフローが可能になり継続的な自動計測時間が提供されます。Creoptix Direct Kinetics評価エンジンによって決定される、絶対計算された結合と解離速度定数の統計誤差(%)は、それぞれ水平軸と垂直軸にプロットされました。以前のアッセイ(緑色のマーク)や制御合物(紫色のマーク)では複雑な挙動を示していなかった化合物は、低誤差で明確に同定されています。また、これまでのアッセイで、大きなバルク屈折率の寄与により複雑性を示していた化合物は、WAVEでは低誤差(青色のマーク)で確実に分析できました。分析が困難な残りの化合物は、大きな誤差(赤色のマーク)によって明確に特性評価されています。

結論

高感度、超高速相互作用を解決する機能、およびwaveRAPIDアッセイ技術を備えたWAVEsystemは、従来のマルチサイクル反応アッセイと比較して、極めて短い時間で大量の薬物ヒット化合物の反応速度特性評価を実行できます。1回の注入で1つのウェルから反応速度を得ることにより、試薬とサンプルの消費量が削減され、初期の創薬に大きなメリットがもたらされます。さらに、waveRAPIDには次のようなメリットがあります。

• 短時間で従来のSPRに匹敵する測定結果
• 接触時間の短縮による、標的タンパク質の保存と長時間中断のないアッセイ
• 測定結果の高い再現性と信頼性
• 1回の注入の結合反応速度で、関連するパラメータに基づいてヒットを選択
• 数週間ではなく数日で多数の相互作用を特性評価
• 詳細な統計誤差計算によって関連するヒットを検出し、問題のある化合物を除外

重要事項

• サンプル接触時間を短縮することで、標的の整合性を維持して長時間の実行を実現
• 単一の注入による結合反応速度
• 従来のSP技術に匹敵する再現性

以下の用途に最適です。

• 粗化合物などのスクリーニング：低分子、フラグメント、およびペプチドなど
• 高速なヒットツーリードの進行
• リード分子の最適化
• 不安定なターゲット
• 困難な化合物
  

謝辞

すべての実験を実施し、本ドキュメントに貢献したGeoffroy Bourquin、Laksmei Goglia、Solange Meyer、Oliver Peterの各氏に謝意を表します。