GPCRの結合反応速度

はじめに

Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、大量の内在性膜タンパク質で構成されており、分子および細胞反応を引き出すために、細胞外刺激の変換に不可欠です。GPCRは、真核生物におけるさまざまな生理学的過程を調製し、治療標的の最大グループ(GPCRを標的とする使用可能な医薬品の30%以上)を構成します。

膜タンパク質は、膜模倣環境の必要性と、細胞膜から抽出された後の不安定性から、研究が困難であることが知られています。ここでは、ペプチドリガンド作動薬(NTA11)とニューロテンシン受容体1 (NTSR1) ¹の熱安定化変異体との相互作用を最高の分解能で測定する、Creoptix WAVEの機能について説明します。このGPCRは、低血圧、高血糖、低体温、痛覚抑制、腸運動と分泌の調節²などのニューロテンシンの複数の機能を仲介します。

材料と方法

この受容体は、AVIタグを介して生体内ビオチン化され、ストレプトアビジンプレコートセンサ(WAVEchip DXH-STA)で捕捉されました。測定したペプチド作動薬には、Y11A置換基を持つ残基8-13で構成されているニューロテンシン(MW 725 Da)の突然変異型および切断型を使用しました。300 Nmが最高濃度の3倍希釈系列の7種類の検体濃度について、容量反応曲線が記録されました。流量は30 μL/分に設定しました。緩衝液は、5 0 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、および0.1%（w/v）の界面活性剤ラウリル基マルトースネオペンチルグリコール（L-MNG）³を使用しました。すべての測定は25°Cで行われています。

結果

精製およびビオチン化されたニューロテンシン受容体は、1350 pg/mm²の密度で、ストレプトアビジンプレコートセンサ(WAVEchip DXH-STA)に捕捉されました。ペプチド作動薬の結合の容量反応曲線が記録され(図1)、質量移行(MTL)の期間を含む1:1相互作用のモデルに適合する結合データが得られました。表1は、取得した運動速度と平衡定数を示しています。

図1: 検体としての修飾ニューロテンシンペプチド(MW 725 Da)と、リガンドとしての熱安定化ニューロテンシン受容体(NTSR1、70 kDaタンパク質/界面活性剤複合体)の相互作用のセンサグラム。データは、WAVEcontrolソフトウェアを使用した質量移行制限(MTL)の期間を含む1:1の相互作用モデルに適合しました。

表1: 質量移行制限(MTL)の期間を含む1:1相互作用モデルで得られたNTA11作動薬の運動速度および解離定数

引用文献

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., and Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., and Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors.Front.Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., and Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization,  stabilization and crystallization of membrane proteins.Nat. Methods 7, 1003–1008.