生物製劑開發中的物性評估技術：配方考量
我們提供生物製劑開發各階段 需評估的項目 及其 可以使用的Malvern Panalytical測量技術。本頁將詳細介紹“配方考量”。
利用擴散係數評估分散穩定性（DLS）
從抗體濃度依賴性比較不同配方條件下的擴散係數
在生物製劑中，動態光散射法（DLS）可用於擴散係數對濃度的圖示，從而評估分散穩定性。下圖顯示了在不同緩衝液中分散的IgG抗體，隨濃度變化的粒子大小由DLS測得的結果。
在緩衝液1（上圖左）中，濃度升高，粒子尺寸增大，擴散係數減小。而在緩衝液2（上圖右），粒子尺寸減小，擴散係數增大。這是因為分子間相互作用的排斥力使得在緩衝液2中的擴散係數看上去較大。下圖是濃度對擴散係數的圖示，斜率為負（藍色）則分散穩定性低，斜率為正（紅色）則分散穩定性高且聚集體較少。
如上所示，利用DLS可評估不同配方條件下樣品的分散穩定性。
利用第二维里系数评估分散稳定性（SLS）
从样品浓度依赖性比较不同配方条件下的第二维里系数
静态光散射法（SLS）能够测定样品的分子量和第二维里系数（B22），可以利用这些参数指示分散稳定性。上段显示了在含有不同浓度NaCl的缓冲液内的溶菌酶的分散稳定性，通过SLS评估的结果。对每个NaCl浓度，变更蛋白浓度以KC/Rθ作图（Debye图），并从斜率中确定B22值。此参数指示溶质和溶媒的关系，通常B22为正表明该蛋白质具有较高的分散稳定性。因此，溶菌酶在含有0% NaCl的缓冲液中具有较高的分散稳定性。
下段将同一抗体在不同缓冲液中的B22进行了比较。由此结果可见，分散稳定性较高的是缓冲液2。
通过使用SLS，可以评估不同配方条件下的蛋白质分散稳定性。
利用电泳光散射法评估分散稳定性（ELS）
比较不同配方条件下抗体的介电泳动电位
电泳光散射法（ELS）是一种光散射技术，可以测量分散性的一个指标：介电泳动电位，介电泳动电位受分子与周围环境（缓冲液类型）的影响。下图显示了在不同缓冲液中IgG的介电泳动电位的比较结果。由于ELS设置较高的盐浓度，测量常不稳定，因此多次测量以确认再现性。在缓冲液1（蓝色），其介电泳动电位较低，从通过介电泳动速度计算出的电荷（数据未显示）为0.8，显示出低的分散稳定性，表明双极子相互作用。在缓冲液2（红色），介电泳动电位和电荷为6.5，表明较高的静电稳定性。
使用ELS可以评估不同配方条件下分子表面相互作用所引起的分散稳定性差异。
Tm 及 Tagg為指標的熱穩定性評估（DLS）
比较10种不同配方条件下重组胺的热稳定性
在活性药物成分（API）的开发中，设计一种能在推荐的处理条件下、提供长期贮存的足够稳定性的制剂非常重要。
通过DLS，可以从升温条件下的粒径变化获得凝集的开始温度（Tagg），从而评估各种溶媒条件下的热稳定性。被认为热稳定性高的条件在长期贮存中也是稳定的。下图是将不同pH值下調配的緩衝液中分散的重组胺通过DLS進行升溫測定的結果。pH 3至10調配的樣本大多顯示出相似的Tm（67至68 ℃）。 在pH為6的條件下製劑的兩個樣本（紅框），在Tm 超過74 ℃前未出現凝集，顯示出極佳的熱穩定性。然而，在pH為3（綠色）和4（黃色）条件下製劑的兩個樣本，從開始升溫的時候顯示出大顆粒度，顯示出已经為變性状态。
透過DLS進行升温測定，可以评估不同配方条件下的热稳定性。
Tm及T1/2為指標的熱穩定性評估（DSC）
比較19種不同配方條件下的抗體的熱穩定性
生物製劑的配方條件（緩衝液種類、pH、添加劑等），可以藉由使用差示掃描卡路裡計（DSC）在各種溶液中比較樣品的熱穩定性，來進行篩選。上段數據為在不同pH條件下對相同抗體進行DSC測試的數據。pH3.5下主峰的位置比pH5.5和6.2更偏向低溫，且變性開始溫度更低，顯示出熱穩定性低的條件。中段圖表展示的是一種抗體在19種不同緩衝液和pH條件下的DSC測試比較，用變性溫度（Tm）來評比。Acetate 5.0至Tris 7.5的12個條件顯示出相似的Tm（中段紅色箭頭），為配方條件的候選。通常透過這種方法可以將製劑條件篩選，但同時，下部圖表顯示的是剛調製的抗體（藍色）和存儲一周後的抗體（黃色），用主峰高度的半溫度寬度（T1/2）進行比較。 T1/2溫度寬度狹窄表明結構較緊密且更穩定，這樣比僅比較Tm的條件還更為篩選（下段紅色箭頭）。
透過使用DSC獲得的多參數，可在不同緩衝液條件下比較樣品的熱穩定性，從而選擇更好的配方條件。
利用散射光進行蛋白聚合體的定量化（NTA）
在藥物開發中，檢測和定量SVP（Sub Visible Particle）是重要的。
纳米粒子跟踪分析法（NTA）通过向液态样品发射激光并以相机捕捉到的散射光来检测，粒子尺寸可以从10 nm*开始检出，而用光学显微镜看不到的亚微米至纳米级粒子可以透过此技術檢測到。此外，通过图像处理追踪在液中的布朗运动，可以通过其速度计算粒径。由此，蛋白質的聚合体从50 nm以上可以检出，填补显微镜与流式细胞仪和色谱分析之间的盲点。
下图显示了检测到的缓冲液中蛋白质中因聚集而能够检测到的散射光强度水平。横轴为尺寸，纵轴为粒子计数。
NTA的使用可以视觉得观察到用传统方法难以检测的聚合体，从而支持更佳的配方條件的確定。*依赖于粒子的材質和密度
利用散射光對不同配方條件下的SVP進行定量評估（NTA）
在胰岛素中添加不同四种抗氧化剂的SVP检测
在NTA中，由于测量领域是已知的，因此可以计算出SVP的粒子浓度。下图显示的是向1 mg/mL的胰岛素中加入100 uM的各种抗氧化剂，并在4℃下存储72小时之后的样品的SVP分析结果。横轴为尺寸，纵轴为粒子计数。可见不含抗氧化剂的PBS溶液中的胰岛素（A）检出的SVP浓度较低。加入的抗氧化剂显示差异，有的产生更多的聚集粒子（B、D、E），有的没有（C）。
使用NTA，可以定量评估不同配方条件的SVP含量，支持更佳的配方条件的确定。
通过粒径分布变化进行热稳定性评估（DLS）
对Con A添加不同四种糖加速实验中的粒径变化进行比较
DLS 可以评估添加剂对蛋白质制剂的热稳定性影响。
下图为在含有1 mg/mL Concanavalin A的样品中加入不同糖（10 mM）后，由DLS进行升温测定的结果，用以评估糖与其结合对热稳定性的影响。横轴表示大小，纵轴表示光强分布（Intensity(%)）。上部的35℃状態显示出干净的单一分散状态，且峰顶的的位置也重合。另一方面，下部47℃的状态时，可以看到根据糖的不同，聚集体的状态（大小，量）存在差异。
结合到主峰10 nm附近的显示，无糖（淡紫）和Galactose（绿色）显示粒径向大偏移，聚集，但Glucose（蓝色）、Fructose（黑色）、Mannose（红色）与Con A结合，显示出提高热稳定性。
使用DLS可以通过粒径变化评估不同添加剂的热稳定性，并由此支持较好的配方条件确定。
利用粒径变化指標進行稳定性评估（SEC-LS）
通过加速实验确认抗体的结合、聚集及片段化
在蛋白質制剂的加速实验中，利用尺寸排除色谱法SEC進行稳定性评估經常被使用。
下图是将IgG抗体在小瓶中设置，在水浴中进行加温的样品的SEC測試结果。在调整之后（红色）和60℃下135分钟后的结果（紫色）相比较，后者的单体比例高于聚体，减少二聚体比例。60℃下保存60小时的样品（绿色）比起凝集，显示出更大的聚集体（红箭头：RV 6 mL 附近）。此外，在单体峰的尾部（黄箭头：RV 10 mL 附近）也出现了片段化。
通过SEC，可以评估在加速试验中样品的稳定性引发的聚集、片段化，从而支持更好的配方条件确定。
| 分子量（Da） （含量（%）） | ||||
| 聚集体 | 二聚体 | 单体 | 未知 | |
| 开始时 | 654、500 (4.5) | 294、500 (14.3) | 147、100 (81.2) | ― |
| 60 ℃ / 135分鐘 | 547、100 (1.8) | 293、500 (5.2) | 145、900 (93.0) | ― |
| 60 ℃ / 60小時 | 3、081、000 (1.2) | 588、400 (9.6) | 156、800 (75.0) | 133、400 (17.2) |
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