生物製藥開發中的物性評估技術：品質管理

經過 Malvern Panalytical, Tuesday, 17th August 2021

我們介紹了生物製藥開發各階段中應評估的項目及可進行這些評估的馬爾文-帕納利提卡的測量技術。在此頁面中，詳細介紹「品質管理」。

製劑化的產品必須始終保持相同的品質。馬爾文-帕納利提卡的測量技術支持使用多個參數為指標的評估和管理，以實現生產批次間及地點間的同等性。

使用多個檢測器的多角度尺寸評估（SEC-LS・Vis）

β-酵素的絕對分子量和固有粘度評估

將光散射檢測器（LS）與尺寸排除色譜（SEC）相結合，可以得到絕對分子量。這一絕對分子量與分子的重量有關，分子越重，散射光越強；反之，分子越輕，散射光越弱。下圖顯示了β-酵素的SEC-LS測量結果。從校準曲線得到的分子量顯示，兩個峰的前部分為聚集體而後部分為單體。然而，進行光散射檢測器的絕對分子量分析顯示，這兩個峰的分子量幾乎相同，但固有粘度值不同，這表明分子的結構不同。由於結構的差異決定分子的體積不同，因此可以認為這兩個峰是由於不同的分子結構而產生的。

這樣使用SEC以多角度參數進行評估，可以准確且詳細地比較製劑化後的蛋白質的尺寸。

	Peak1	Peak2
溶出量（mL）	14.60	15.97
分子量（g/mol）	209、200	214、200
固有粘度(dL/g)	0.1572	0.05705

→可以準確評估製劑化的蛋白質製劑的尺寸和分子量。

T_m及T_1/2為指標的不穩定化預測（DSC）

強制氧化對抗體熱穩定性的影響

在差示掃描量熱法（DSC）中，可以使用熱穩定性作為指標來比較和檢驗製劑化後儲存或運輸期間可能發生的氧化等影響。下圖顯示了抗體在強制氧化前後的DSC測量結果。氧化後樣品的首個出現的T_m1變性開始溫度（T_onset）比氧化前下降且峰值變得更寬。而主要峰值T_m2則不受太大影響。這些結果表明，這種抗體中Fc-CH2區域因氧化而失穩定性。

這樣使用DSC可以評估抗體藥物因氧化而受到影響的區域。

→可以評估氧化對蛋白質製劑穩定性的影響。

以焓變化為指標的結合活性確認（DSC）

gp120的熱穩定性及其與CD4的結合活性之間的關係

DSC所獲得的數據表明，如果樣品保持其高次結構，則在相同濃度和相同緩衝液條件下，峰值將完全重合。下圖（a）為gp120蛋白在不同批次之間的DSC數據。峰頂均位於61 ℃左右，但峰的大小有所不同，這意味著不同批次之間存在差異。（b）圖將（a）中所獲得的焓變化（相當於峰值面積）作橫軸，將與gp120結合的CD4的結合活性（%）作縱軸進行繪圖。由於焓變化與結合活性具有線性關係，因此焓變小可能表明該批次中存在不活性的分子。

這樣運用DSC可以進行生產後的品質評估。

→通過比較T_m和ΔH可以進行批次及地點之間的結合活性評估。

以峰形相似性為指標的同等性評估（DSC）

抗體批次之間的同等性評估

DSC獲得的熱圖顯示，如果樣品保持其高次結構，則在相同濃度和緩衝液條件下會出現相同形狀（指紋）。如果觀察到不同形狀，則意味著樣品中存在結構部分不穩定的成分。此外，即使形狀相似，若峰面積較小，可能表明樣品中已存在變性物質。

下圖為製劑化後抗體批次之間的同等性評估。由於每個熱圖很好地一致，因此表明每個批次之間保持同等性。

這樣使用DSC可以評估批次和地點之間蛋白質製劑的同等性。

→以熱圖為指紋進行批次和地點之間的同等性評估。

以親和力和結合比為指標的同等性評估（ITC）

不同批次蛋白質的結合活性評估

等溫滴定量熱法（ITC）所得的結合比（n）是由數據的橫軸表示的”針筒樣品濃度/槽樣品濃度”的值。一般來說，蛋白質被放入槽中，通過比較結合比來評估蛋白質的結合活性。下圖顯示了某種蛋白質在不同批次之間的結合活性ITC分析結果。在針筒中裝填了作為正控的肽。所得的Sigmoid曲線的傾斜度幾乎相同，觀察親和力發現，批次1為97.1 nM，而批次2為135 nM，差異不大。然而，從結合比來看，批次1為1.05 sites，而批次2為0.235 sites。若蛋白質的結合活性得以保持，理論上結合比應為1（100%結合），故批次2的蛋白質結合活性僅保留約24%。

這樣使用ITC可以評估批次和地點之間蛋白質製劑的結合活性是否得到保持。

→通過K_D和結合比為指標進行批次和地點之間的同等性評估。

以粒徑和PdI為指標的尺寸及粒徑分佈評估（DLS）

不同儲存條件下抗體的膠體穩定性比較

抗體的儲存條件對其品質有重大影響。通過動態光散射法（DLS）測量粒徑，可以評估當前使用的儲存條件是否最佳。

下圖是不同儲存條件下IgG的粒徑測量結果。儲存在4 ℃下35天的樣品（綠色）沒有聚集體，而且PdI（多分散指數）也較小。然而，經歷5次凍結/解凍循環的樣品（紅色）顯示出聚集體增加，PdI也非常大。儲存於25℃下31天的樣品（藍色）幾乎沒有聚集體，但PdI稍大一些。因此，為了更詳細地觀察儲存條件的影響，除了粒徑之外，與PdI一起進行比較和評估也是有效的。

這樣在不同儲存條件下使用DLS可以對製劑化後的蛋白質的尺寸和粒徑分佈進行時間序列評估，以達到儲存條件的優化。

→使用粒徑和PdI進行不同長期儲存條件下的品質評估。

通過散射光評估SVP的經時變化（NTA）

在極端條件下評估抗體的SVP經時變化

品質管理活動中需要利用加速試驗來評估藥品。在此過程中，除粒徑外，將納米粒子追蹤分析（NTA）中粒子濃度作為另一參數加入，可以進行更詳細的評估。下圖顯示了在比通常加速試驗更嚴酷的條件下的IgG的NTA評估。對1 mg/mL調製的IgG進行50 ℃加熱，隨著時間推移可觀察到SVP濃度增加和更大聚集體的形成。

利用NTA可以進行SVP的定量評估。