Técnicas de Evaluación de Propiedades Físicas en el Desarrollo de Biofármacos: Selección de Candidatos

Proporcionamos información sobre los factores a evaluar en cada etapa del desarrollo de biofármacos y las tecnologías de medición de Malvern Panalytical que permiten dichas evaluaciones. En esta página, presentamos en detalle sobre la «selección de candidatos».

Determinación del tamaño de partícula y evaluación de agregados mediante distribución de tamaños (DLS)

Medición del tamaño de la globina

Es importante filtrar de manera sencilla y rápida las muestras objetivo entre muchos candidatos. El método de dispersión dinámica de luz (DLS) puede determinar el tamaño y estado de dispersión de las partículas de muestra en unos minutos, permitiendo una rápida identificación de agregados. El gráfico a continuación muestra un eje horizontal representando el tamaño (radio hidrodinámico) y un eje vertical la distribución de intensidad de la luz, resultado de mediciones de tamaños de partícula de diferentes globinas. La tabla muestra que la HbA (azul) y Hemocyanin (negro) tienen un único pico en intensidad, mientras que Rice Hb1 (verde) y Polytaur (gris) tienen una amplia distribución de tamaños, indicando la mezcla de moléculas de mayor tamaño.

Usando DLS, es posible identificar la proporción de monómeros, dímeros y oligómeros de orden superior en una muestra observando la determinación de tamaños de partícula y la relación de áreas de picos. Además, DLS pueden usarse para estimar el peso molecular basándose en información del tamaño de partícula, y para determinar eficazmente el estado de oligómeros y los agregados presentes en la muestra.

Evaluación precisa de peso molecular e información estructural usando múltiples detectores (SEC-LS・Vis)

Evaluación de apo-RD y holo-RD

Con los métodos analíticos tradicionales basados en la capacidad de retención usando sustancias estándar, cuando el volumen aparente aumenta debido a cambios estructurales en las proteínas, existe el riesgo de interpretar erróneamente el peso molecular. Para obtener un peso molecular preciso, es eficaz conectar un detector de dispersión de luz (LS) al cromatógrafo de exclusión por tamaños (SEC) y realizar el análisis mediante luz dispersada. El gráfico a continuación muestra el resultado de medir la proteína RD (Repeat in Toxin Domain), que cambia su estructura en presencia de iones de Ca, con y sin CaCl₂ (holo y apo). Comparando los estados holo (línea continua) y apo (línea discontinua), el tiempo de elución de apo es más temprano, lo que con métodos tradicionales sugeriría que el peso molecular de apo sería 600 kDa y holo 73 kDa, interpretándose como que apo está en un estado agregado. Sin embargo, el análisis usando dispersión de luz mostró que el peso molecular de ambos era alrededor de 73 kDa. Comparando viscosidad intrínseca obtenida del detector de viscosidad, se observa una diferencia significativa entre apo (0.35 dL/g) y holo (0.055 dL/g), indicando que la presencia de iones de Ca induce un cambio estructural en la proteína.

Por lo tanto, al medir simultáneamente con múltiples detectores, es posible obtener información precisa de peso molecular y estructura, evitando errores en la selección de constructos.

Determinación del tamaño de partícula y evaluación de agregados usando múltiples detectores (SEC-LS・Vis)

Evaluación de pureza de anticuerpos

La luz dispersada tiende a ser más fuerte cuanto mayor es el peso molecular. Al conectar un detector de dispersión de luz al SEC, es posible observar claramente áreas de agregados que son difíciles de identificar con detectores RI o UV/VIS tradicionales. El gráfico a continuación muestra el resultado de medir IgG usando un detector RI y un detector de dispersión de luz conectados al SEC. Los monómeros y dímeros son visibles en ambos, señal RI (rojo) y señal de dispersión de luz (naranja), pero en áreas de agregados, se confirma que la señal de dispersión de luz es más grande que la señal RI (flecha roja). Los detectores RI y UV/VIS dependen de la concentración para cambiar la señal, por lo que los pequeños agregados existentes tienden a generar una cantidad de señal pequeña. Con la adición del detector de dispersión de luz, es posible discriminar si realmente existen agregados o si es una fluctuación de la línea base.

Usar SEC-LS・Vis permite confirmar con mayor precisión la pureza de la muestra, facilitando así la elección de constructos de mayor pureza deseada.

Selección de constructos por comparación de estabilidad térmica (DSC)

Comparación de estabilidad térmica entre 12 tipos de anticuerpos con mutación introducida en el Fab

Es conocido que las proteínas cambian en actividad y estabilidad con la introducción de mutaciones, y se cree que el aumento de la estabilidad influye en la actividad. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) permite evaluar la estabilidad térmica de proteínas sin etiquetado. El gráfico a continuación muestra los datos de DSC de la forma silvestre (WT) y 12 mutantes de Fab de un anticuerpo que reconoce el toxoide tetánico. El eje horizontal representa la temperatura y el vertical la capacidad calórica necesaria para la desnaturalización. Mientras que el T_m (temperatura de la cima del pico principal) del Fab WT fue de 78.7 °C, el mutante V11 mostró una mejora de 13.3 °C de estabilidad, con un T_m de 92 °C.

Así, usando DSC es posible identificar cómo pequeñas diferencias en la secuencia de la región variable de un anticuerpo afectan su estabilidad térmica y acotar los candidatos de constructos más estables.

Selección de constructos por actividad de enlace (ITC)

Interacción de chaperona de histonas con tres diferentes péptidos de histonas

En el desarrollo de medicamentos, es crucial seleccionar eficientemente candidatos con mayor afinidad por las proteínas objetivo. La calorimetría isotérmica de titulación (ITC) permite determinar la afinidad, especificidad y mecanismo de enlace en una sola medición de interacciones moleculares.

El gráfico debajo compara la interacción de tres péptidos de histonas diferentes (10-mer) con el dominio PHD (plant homodomain) del chaperón de histonas TAF3(TBP(TATA binding protein)-associated factor). La parte superior muestra los datos brutos medidos, mientras que la parte inferior grafica la relación molar en el eje x y el cambio de entalpía (△H) indujo por la interacción en el eje y. Estas interacciones presentan una curva sigmoide típica de enlace 1:1, sugiriendo diferentes afinidades para los péptidos según el análisis de ajuste. Las diferencias de afinidad se reflejan en la pendiente de la curva: cuanto más vertical, mayor afinidad; cuanto más horizontal, menor afinidad.

De esta manera, utilizando ITC, es posible seleccionar constructos con mayor afinidad.

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