Tecnologías de Evaluación de Propiedades Físicas en el Desarrollo de Productos Biofarmacéuticos: Revisión de Formulaciones
Presentamos los elementos a evaluar en cada etapa del desarrollo de biofármacos y las tecnologías de medición de Malvern Panalytical que permiten dicha evaluación. En esta página, presentamos un detalle sobre la «Revisión de Formulaciones».
Evaluación de la estabilidad de la dispersión usando el coeficiente de difusión (DLS)
Comparación del coeficiente de difusión en diferentes condiciones de formulación según la dependencia de la concentración de anticuerpos
En biofármacos, al graficar el coeficiente de difusión obtenido por el método de dispersión de luz dinámica (DLS) contra la concentración, es posible evaluar la estabilidad de la dispersión. La figura a continuación muestra el resultado de medir el tamaño de las partículas de un anticuerpo IgG disperso en diferentes tampones a diferentes concentraciones usando DLS.
En el tampón 1 (arriba a la izquierda), se puede confirmar que el tamaño de las partículas aumenta y el coeficiente de difusión disminuye a medida que aumenta la concentración. En contraste, en el tampón 2 (arriba a la derecha), se puede confirmar que el tamaño de las partículas disminuye y el coeficiente de difusión aumenta. Esto se debe a que la interacción repulsiva intermolecular afecta al coeficiente de difusión aparente, haciéndolo mayor en el tampón 2. La figura a continuación muestra un gráfico del coeficiente de difusión contra la concentración, donde se puede observar que si la pendiente de la línea es negativa (azul), la estabilidad de la dispersión es baja, y si la pendiente es positiva (roja), la estabilidad de la dispersión es alta y los agregados son pocos.
Así, utilizando DLS, es posible evaluar la estabilidad de la dispersión de muestras bajo diferentes condiciones de formulación.
Evaluación de la estabilidad de dispersión usando el segundo coeficiente de virial (SLS)
Comparación del segundo coeficiente de virial en diferentes condiciones de formulación según la dependencia de la concentración de la muestra
La dispersión de luz estática (SLS), una de las técnicas de dispersión de luz, permite determinar el peso molecular de la muestra y el segundo coeficiente de virial (B22), sugiriendo la estabilidad de dispersión a través de estos parámetros. La parte superior muestra los resultados de la evaluación de la estabilidad de dispersión de lisozima en diferentes concentraciones de NaCl en solución buffer evaluada mediante SLS. Al cambiar la concentración de proteínas en cada concentración de NaCl, se traza KC/Rθ (gráfico de Debye) y se obtiene B22 a partir de la pendiente. Este parámetro muestra la relación entre el soluto y el solvente, indicativo de estabilidad de dispersión si B22 es positivo. De esto, se sugiere que la lisozima tiene una alta estabilidad de dispersión en la solución buffer con 0% NaCl.
La parte inferior muestra una comparación de B22 para el mismo anticuerpo en diferentes buffers. De esto, se puede concluir que el buffer 2 tiene una alta estabilidad de dispersión.
Usando SLS, es posible evaluar la estabilidad de dispersión de proteínas en condiciones de formulación diferentes.
Evaluación de la estabilidad de dispersión usando dispersión de luz electroforética (ELS)
Comparación del potencial Z en diferentes condiciones de formulación para anticuerpos
El potencial Z, uno de los indicadores de dispersión, se mide mediante la dispersión de luz electroforética (ELS) y se determina por el tipo de entorno (tipo de buffer) alrededor de la molécula. La figura de abajo muestra los resultados de comparar el potencial Z de IgG en diferentes buffers. Ya que ELS tiende a ser inestable con alta concentración salina, la estabilidad de la medición se verifica tomando múltiples lecturas. En el buffer 1 (azul), el potencial Z es bajo y la carga calculada a partir de la movilidad electroforética (dato no mostrado) es también baja (0.8), lo que indica una baja estabilidad de dispersión y sugiere interacción dipolar. En el buffer 2 (rojo), el potencial Z y la carga son altos (6.5), sugiriendo alta estabilidad electroestática.
Usando ELS, es posible evaluar las diferencias en la estabilidad de dispersión debido a las interacciones en la superficie de la molécula en diferentes condiciones de formulación.
Tm y Tagg como referencia para la evaluación de estabilidad térmica (DLS)
Comparación de estabilidad térmica de reductor de recombinante en 10 condiciones de formulación diferentes
En el desarrollo de ingredientes activos farmacéuticos (API), es importante diseñar formulaciones que proporcionen estabilidad suficiente a largo plazo bajo condiciones recomendadas de manejo.
En DLS, el cambio en el tamaño de las partículas bajo condiciones de calentamiento proporciona la temperatura (Tagg) a la que comienza la agregación, permitiendo la evaluación de la estabilidad térmica en diferentes condiciones de solvente. Se considera que condiciones con alta estabilidad térmica son igualmente estables durante el almacenamiento a largo plazo. La figura de abajo muestra los resultados del análisis de calentamiento de reductor de recombinante disperso en buffers ajustados a diferentes pH mediante DLS. La mayoría de las muestras formuladas entre pH 3-10 mostraron un Tm similar (67-68 °C). Dos muestras formuladas a pH 6 (recuadro rojo) no comenzaron a agregarse hasta que se excedieron los 74 °C de Tm, mostrando la mayor estabilidad térmica. En contraste, dos muestras formuladas a pH 3 (verde) y 4 (amarillo) ya mostraban un estado de desnaturalización a partir del gran tamaño de partículas observado desde el inicio del calentamiento.
Realizando análisis de calentamiento mediante DLS, se puede evaluar la estabilidad térmica en diferentes condiciones de formulación.
Tm y T1/2 como referencia para la evaluación de estabilidad térmica (DSC)
Comparación de la estabilidad térmica de anticuerpos en 19 condiciones de formulación diferentes
Las condiciones de formulación de biofármacos (tipo de buffer, pH, aditivos, etc.) pueden aclararse al comparar la estabilidad térmica de muestras en diversas soluciones usando la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los datos de arriba muestran la comparación mediante DSC de un anticuerpo en tres condiciones diferentes de pH donde el pico principal cambia hacia temperaturas más bajas a pH 3.5 en comparación con 5.5 y 6.2, indicando que las condiciones con menor estabilidad térmica. El gráfico del medio muestra la comparación de la temperatura de desnaturalización del pico principal (Tm) en 19 condiciones de buffer y pH para un mismo anticuerpo. Doce condiciones desde acetate 5.0 a tris 7.5 mostraron Tm similares (flecha roja en el medio), indicando condiciones de formulación candidatas. Normalmente se reduce el número de condiciones de formulación con este método, pero al agregar el análisis de la T1/2 del ancho del pico a mitad de la altura máxima en las mismas condiciones (gráfico de abajo, flecha roja), las condiciones se afinan aún más.
Con múltiples parámetros obtenidos de DSC, una comparación de estabilidad térmica bajo diferentes condiciones de buffer permite determinar las mejores condiciones de formulación.
Cuantificación de agregados proteicos mediante dispersión de luz (NTA)
Es importante detectar y cuantificar SVP (partículas subvisibles) durante el desarrollo farmacéutico.
El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) proyecta directamente un láser sobre las partículas en suspensión y detecta el patrón de luz dispersa con una cámara, permitiendo detectar partículas submicrónicas y de tamaño nano que no pueden ser vistas con un microscopio óptico, desde un tamaño mínimo de 10 nm*. Al seguir el movimiento browniano en el agua a través de imágenes procesadas, se puede calcular el tamaño de las partículas a partir de su velocidad. Agregados proteicos mayores de 50 nm pueden ser detectados, cubriendo la brecha entre el análisis con microscopio, citometría de flujo y cromatografía.
La figura inferior detecta agregados fuertes entre las proteínas del buffer hasta niveles de dispersión de luz detectables. El eje horizontal representa el tamaño y el eje vertical el número de partículas.
Usando NTA, es posible visualizar agregados previamente indetectables con métodos convencionales, apoyando así la decisión de mejores condiciones de formulación. *Depende del material y densidad de las partículas.
Evaluación cuantitativa de SVP bajo condiciones de formulación diferentes usando dispersión de luz (NTA)
Detección de SVP para insulina con cuatro antioxidantes diferentes
En NTA, debido a que el área de medición es conocida, es posible calcular la concentración de partículas SVP. La figura de abajo muestra el resultado del análisis de SVP de insulina a 1 mg/mL con 100 μM de diferentes antioxidantes, después de 72 horas de almacenamiento a 4 °C. El eje horizontal representa el tamaño y el eje vertical el número de partículas. Insulina en PBS sin antioxidantes (A) mostró una baja concentración de SVP detectados. Se observó diferencia entre los antioxidantes en cuanto a si inducían más partículas agregadas (B, D, E) o no (C).
Usando NTA, es posible realizar una evaluación cuantitativa de SVP bajo diferentes condiciones de formulación, apoyando así la decisión de mejores condiciones de formulación.
Evaluación de estabilidad térmica mediante cambio en distribución de tamaño de partículas (DLS)
Comparación de cambio de tamaño en prueba acelerada con cuatro azúcares agregados a ConA diferentes
En DLS, es posible evaluar la estabilidad térmica al añadir aditivos a formulaciones proteicas.
La figura de abajo muestra el resultado de medir el efecto de cuatro azúcares (10 mM) añadidos a 1 mg/mL de concanavalina A (Con A) mediante DLS, observando cómo el enlace con estos azúcares afecta la estabilidad térmica durante el calentamiento. El eje horizontal representa el tamaño y el eje vertical la distribución de intensidad lumínica (Intensity(%)). En la parte superior, a 35 °C, se observa un estado monodisperso limpio, confirmándose que la posición del pico es similar. En la parte inferior, a 47 °C, las distintas condiciones de azúcares muestran diferencias en el estado de agregación (tamaño, cantidad).
Del estado alrededor de 10 nm del pico principal, se sugiere que sin azúcar (lila claro) y galactosa (verde) están unidos a Con A y mejoran la estabilidad térmica, mientras que la glucosa (azul), fructosa (negro) y manosa (rojo) aumentan el tamaño de las partículas y muestran agregación.
Usando DLS, es posible evaluar el impacto térmico de diferentes aditivos mediante el cambio en tamaño, apoyando la decisión de mejores condiciones de formulación.
Evaluación de estabilidad usando cambios de tamaño como referencia (SEC-LS)
Evaluación de estabilidad mediante prueba acelerada para verificar asociación, agregación y fragmentación de anticuerpos
La exclusión de tamaño en cromatografía (SEC) se usa comúnmente para evaluar la estabilidad mediante pruebas aceleradas en formulaciones proteicas.
La figura de abajo muestra la comparación de SEC para una muestra de anticuerpo IgG a diferentes tiempos y temperaturas en un baño de agua. En comparación con la muestra inmediatamente después de la preparación (rojo) y la mantenida a 60 ℃ durante 135 minutos (morado), esta última muestra una mayor proporción de monómeros y menor de dímeros. La muestra mantenida a 60 ℃ durante 60 horas (verde) muestra aceleración en la agregación con formación de agregados mayores (flecha roja: cerca de RV 6 mL). También se identificó la aparición de fragmentos en la parte posterior del pico de monómeros (flecha amarilla: cerca de RV 10 mL).
Usando SEC, es posible evaluar la agregación y fragmentación debida a la estabilidad de la muestra en pruebas aceleradas, apoyando la decisión de mejores condiciones de formulación.
| Peso Molecular (Da) (Contenido (%)) | ||||
| Agregado | Dímero | Monómero | Desconocido | |
| Inicio | 654,500 (4.5) | 294,500 (14.3) | 147,100 (81.2) | ― |
| 60 ℃ / 135 min | 547,100 (1.8) | 293,500 (5.2) | 145,900 (93.0) | ― |
| 60 ℃ / 60 h | 3,081,000 (1.2) | 588,400 (9.6) | 156,800 (75.0) | 133,400 (17.2) |
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