Tecnologías de evaluación de propiedades en el desarrollo de biofármacos: Control de calidad

Presentamos los parámetros a evaluar en cada etapa del desarrollo de biofármacos y las técnicas de medición de Malvern Panalytical que permiten su evaluación. En esta página, presentamos en detalle el ‘Control de calidad’.

Evaluación de tamaño desde múltiples ángulos con varios detectores (SEC-LS・Vis)

Evaluación del peso molecular absoluto y de la viscosidad intrínseca de β-amilasa

Al combinar cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con detectores de dispersión de luz (LS) es posible determinar el peso molecular absoluto. Este peso molecular absoluto está correlacionado con la masa del molécula; a mayor masa, mayor dispersión de luz, y a menor masa, menor dispersión de luz. La siguiente figura muestra los resultados de la medición SEC-LS de β-amilasa. Al analizar el peso molecular calculado a partir de la curva de calibración, los dos picos son interpretados como agregados al comienzo y monómeros al final. Sin embargo, al realizar análisis con detectores de dispersión de luz, se observa que los pesos moleculares de los dos picos son casi iguales y los valores de viscosidad intrínseca son diferentes, lo que sugiere diferencias estructurales. Las diferencias estructurales implican distintos volúmenes moleculares, lo que justifica la aparición de dos picos.

Utilizando parámetros versátiles con SEC, es posible realizar comparaciones detalladas y precisas del tamaño de proteínas formuladas.

Predicción de desestabilización basada en T_m y T_1/2 (DSC)

Impacto en la estabilidad térmica de anticuerpos debido a oxidación forzada

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) permite comparar y analizar los efectos de la oxidación que pueden ocurrir durante el almacenaje o transporte de la formulación, evaluando la estabilidad térmica. A continuación se muestran los resultados de DSC antes y después de someter a los anticuerpos a oxidación forzada. El inicio de la desnaturalización T_m1 del primer pico después de la oxidación muestra una temperatura de inicio T_onset más baja en comparación con antes de la oxidación y un pico más amplio. Sin embargo, el pico principal T_m2 no se ve tan afectado. Estos resultados sugieren que el dominio Fc-CH2 de este anticuerpo fue desestabilizado por la oxidación.

DSC permite así evaluar qué dominio de un anticuerpo terapéutico es afectado por la oxidación.

Confirmación de actividad de unión usando cambios de entalpía como indicador (DSC)

Correlación entre la estabilidad térmica de gp120 y su actividad de unión con CD4

Los datos obtenidos en DSC muestran picos completamente coincidentes en condiciones de misma concentración y buffer, siempre que la estructura terciaria del muestra se mantenga. El gráfico (a) muestra los datos de DSC de diferentes lotes de la proteína gp120, donde los picos coinciden alrededor de 61 °C, pero varían en magnitud. El gráfico (b) muestra en el eje vertical la actividad de unión con CD4 y en el eje horizontal el cambio de entalpía obtenido en (a), mostrando una correlación lineal. La disminución del cambio de entalpía indica la presencia de moléculas inactivas en el lote.

Utilizando DSC, es posible evaluar la calidad post-producción.

Evaluación de equivalencia usando la similitud de la forma del pico como indicador (DSC)

Evaluación de equivalencia en diferencias entre lotes de anticuerpos

En DSC, si la estructura superior de la muestra se conserva, el termograma obtenido bajo las mismas condiciones de concentración y buffer será idéntico (huella digital). Diferencias en la estructura del termograma sugieren inestabilidades estructurales parciales en la muestra. Asimismo, una disminución en el área del pico, incluso si es similar, indica la presencia de muestra desnaturalizada ya en solución.

El gráfico a continuación evalúa la equivalencia entre lotes de un anticuerpo post-formulación. La coincidencia de los termogramas sugiere que se mantiene la equivalencia entre cada lote.

DSC permite evaluar la equivalencia de las formulaciones proteicas entre lotes y ubicaciones.

Evaluación de equivalencia usando afinidad y ratio de unión como indicadores (ITC)

Evaluación de actividad de unión en proteínas de diferentes lotes

El ratio de unión (n) obtenido por calorimetría de titulación isoterma (ITC) indica la relación «concentración de la muestra de jeringa/concentración de la muestra en la celda». Generalmente, se coloca una proteína en la celda, y comparando el ratio de unión, se evalúa la actividad de unión de la proteína. La siguiente figura compara la actividad de unión de una proteína entre diferentes lotes usando ITC, introduciendo un péptido positivo en la jeringa. Las curvas sigmoides resultantes muestran pendientes equivalentes y afinidades similares: 97.1 nM para el lote 1 frente a 135 nM para el lote 2. Sin embargo, el ratio de unión es de 1.05 para el lote 1 y 0.235 para el lote 2, lo que implica una retención del 24% de la actividad de unión en el lote 2 frente al teórico 100%.

ITC permite evaluar si se conserva la actividad de unión en formulaciones proteicas entre lotes y ubicaciones.

Evaluación de tamaños y distribuciones de partículas usando tamaño y PdI como indicadores (DLS)

Comparación de estabilidad coloidal de anticuerpos bajo condiciones de almacenamiento diferentes

Las condiciones de almacenamiento de anticuerpos afectan significativamente su calidad. La medición del tamaño de partículas por dispersión de luz dinámica (DLS) permite evaluar la optimización de las condiciones utilizadas.

La siguiente figura muestra los resultados de medidas de tamaño de partículas de IgG bajo distintas condiciones de almacenamiento. En el estado almacenado a 4 °C por 35 días (verde), se confirma la ausencia de agregados y un índice de dispersión de partículas (PdI) bajo. En contraste, las condiciones de conservación tras congelamiento/descongelamiento repetido cinco veces (rojo) muestran muchos agregados y un PdI muy alto. Las muestras almacenadas a 25 °C por 31 días (azul) casi no tienen agregados, pero muestran un PdI ligeramente elevado. Evaluar usando tanto tamaño de partículas como PdI es efectivo para ver el impacto detallado de las condiciones de almacenamiento.

La evaluación del tamaño y distribución de partículas formuladas bajo diferentes condiciones de almacenamiento usando DLS de manera temporal permite la optimización de las condiciones de almacenamiento.

Evaluación del SVP a través del tiempo usando dispersión de luz (NTA)

Observación del SVP tras someter anticuerpos a condiciones extremas

En la gestión de calidad, se buscan evaluaciones aceleradas de medicamentos. Aparte del tamaño de partículas, considerar la concentración de partículas por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es considerado para evaluaciones más detalladas. A continuación se muestra la evaluación de IgG bajo condiciones extremas mediante NTA. Para IgG a una concentración de 1 mg/mL calentado a 50 °C, la aparición de SVP se analiza y muestra incrementos en concentración y tamaño con el tiempo.

NTA permite una evaluación cuantitativa del SVP.

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