マルチ検出器GPC/SECはどのように機能しますか？

あなたのサンプルが合成ポリマーや多糖類などの天然素材、タンパク質、抗体、その他の生物試料であるかにかかわらず、ゲル浸透クロマトグラフィー / サイズ排除クロマトグラフィー (GPC/SEC) は、それらおよび他のタイプの高分子を特性評価するための理想的な手法です。 GPC/SEC分析から提供される情報には、分子量（MW）、分子サイズ、動的半径 (Rh) および回転半径 (Rg)、内因性粘度（IV）、濃度、組成分析、および分岐データなどのパラメータが含まれます。利用可能なデータは、存在する検出器の組み合わせに依存し、さまざまな検出器が組み合わさって特性評価のパズルの違うピースを提供します。この投稿では、OMNISEC および Viscotek TDA プラットフォームで利用可能な異なる検出器がどのように協力してサンプルの包括的な特性評価を提供するかを解説します。詳細（および方程式！）については、マルチ検出器GPC/SECの原理に関するホワイトペーパーをご覧ください。

上の図に検出器と分子パラメータの関係がグラフで要約されています。このチャートは、各検出器によって直接測定されるサンプル属性から始まり、観測された検出器の応答から直接計算された値に進み、直接計算されたデータから計算された情報で上端が終わります。

完全装備のマルチ検出器GPC/SECシステムに最も一般的に関連する4つの検出器は、微分屈折率（RI）検出器、光散乱検出器（RALS/LALSまたはMALS）、微分粘度計検出器、そしてUV検出器です。これらの検出器が反応するサンプルの特定の特徴は、上の図の最下段に示されています。RI検出器は、サンプル溶液と空の溶媒の間の屈折率の変化に応答します。光散乱検出器は、主にサンプルの分子量に応答し、分子量の高いサンプルはより強い応答を引き起こします。微分粘度計の信号は、サンプル溶液の溶液粘度と空の溶媒と比較した差に基づいています。そしてUV検出器の応答は、サンプルの吸収レベルに基づいています。UV光を吸収しないクロモフォアを持たないサンプルは、UV信号を生成しません。

他のどの検出器が存在するかどうかにかかわらず、すべてのGPC/SECシステムは少なくとも1つの濃度検出器を持たなければなりません。RIおよびUV検出器は、応答がサンプルの濃度に直接比例するため、濃度検出器と見なされます。多くのサンプルはUV活性ではないため、ほとんどのシステムはRI検知器を使用します。dn/dc値、すなわち屈折率の増分を知ることで、RI検出器から各データスライスの正確なサンプル濃度を計算することができます。同様に、UV検出器を使用する場合、dA/dc値、またはモル吸光係数に関連した値を知ることで、各データスライスでのサンプル濃度を計算することができます。RIおよびUV検出器の両方を用いることで、2成分からなるサンプルの組成を決定することができます。

各記録されたデータスライスでの正確なサンプル濃度を知ることは重要であり、これは前の階層図の直接計算された中央セクションに含まれる主な分子パラメータである分子量と内因性粘度を決定するのに必要です。上記にリストされた検出器応答を支配する方程式を調べると、なぜサンプル濃度が重要かが明らかになります。光散乱の方程式に焦点を当てると、検出器出力が観測され、K_LS は狭い標準を分析することで得られる検出器定数を表し、分子量は未知で、dn/dc値はRI検出器の方程式で濃度を計算するために使用されることから既知であり、その後光散乱方程式に組み込まれ、注入量はユーザーによって設定されるため既知です。分子量が唯一の未知数として残ります。RIおよび光散乱検出器の組み合わせにより、各データスライスでのサンプルの分子量を計算することができます。計算された分子量は、定義されたサンプルピークに基づいて積分され、分子量モーメントが各割合の相対濃度に基づいて計算されます。

同様のプロセスが、RIおよび粘度計検出器と共に実行され、各データスライスでのサンプルのIVを直接計算し、重量平均のIV値を生成します。

中央の直接計算されたデータから移動すると、階層図の最上位は、サンプルの分子量とIVが組み合わされてサンプルの分子構造への洞察を提供するパラメータを間接的に計算できることを示しています。

通常、サンプルのサイズは、頻繁に求められる特性評価データの中で分子量に次いで重要です。Rhはすべてのサンプルタイプに最も適したサイズパラメータです。Rgは、少なくとも2つの角度を持つ光散乱検出器および濃度検出器から計算できます（そのため、中間層に位置しています）が、サンプルが角度依存を示すのに十分なサイズである必要があります。タンパク質を含む多くのサンプルはそれほど大きくありませんので、これらのサンプルのRgを計算することはできません。これに対して、濃度検出器、光散乱検出器、および粘度計検出器からのデータが十分に提供され、分子量およびIVデータを生成することができれば、Rhを計算することができます。Rhは、計算された分子量およびIV<эでサンプルが占有する理論的球の半径を表現します。IVは、dL/g、すなわち体積を質量で割った量として記述されるため、分子量質量と組み合わせてサンプルの理論体積を計算することができます。（4/3）πr³を基にした球形モデルが適用され、最終的にはサンプルのRhが求められます。

マルク・ハウィンク（MH）パラメータは、サンプルのIVをその分子量に対してプロットすることでその関係の視覚的表現を提供するMHプロットから計算されます。これらのMHプロットは、3つの検出器（濃度、光散乱、および粘度計）から取得したデータを使用し、単一サンプル内の分子構造の変化を示したり、複数のサンプル間の違いを際立たせたりすることができます。これらのプロットの頻繁な使用例は、サンプルの分布内の分岐の程度を特定および定量化することです。

マルチ検出器GPC/SEC分析は、異なる分子パラメータを測定する一連の検出器を使用して、サンプルのさまざまな側面に関する一連の特性評価データを提供します。完全な検出器を揃えて協調的に動作させることで、1つの検出器システムでは利用できないはるかに多いデータのコレクションが得られます。個々の検出器の直接測定を通じて、特定のパラメータが直接計算されます。そしてそこから、ソフトウェアはさらなる間接的に計算された追加データも得ることができ、結果としてサンプルに構造的な洞察を提供する情報が完成します。すべてはサンプルの単一注入から得られます！

以前の投稿：

• 組成分析のためのGPC/SECの使用
• GPC/SECはサンプルが分岐しているかを判定できますか？
• どの光散乱検出器が自分に最適ですか？
• dn/dc値とは何ですか？そしてなぜGPC/SECに重要ですか？
• 光散乱検出器を備えたGPC/SECシステムを持っている場合、なぜ標準が必要ですか？