NTA（ナノ粒子追跡分析）を利用した薬物デリバリーナノ粒子の視覚化、サイズおよび数の測定

薬物デリバリーにナノ粒子を使用するケースが急速に増加しています。ナノ粒子は優れた薬動学的特性、持続的かつ制御された放出、特定の細胞、組織、または器官への標的化が可能です。ナノ粒子薬物デリバリーが多くの注目を集めたのは、疾患治療のために治療法として利用可能な新しい生物活性化合物の発見速度が鈍化したためでもあります。毎年市場に紹介される新薬の数が減少する中で、薬物デリバリーのためにナノ粒子の多目的、かつ多機能的な構造の利用への関心が急速に高まっています。これらのすべての特徴は、既存薬物の効能を向上させることができます。

薬物デリバリーに使用されるナノ粒子は、さまざまな組成のさまざまな物質で作られる1マイクロン未満のコロイドとして定義されています。一般的に定義されるナノ粒子ベクターには、リポソーム、ミセル、デンドリマー、固体脂質ナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、高分子ナノ粒子などがあります。ナノ粒子はさまざまな方法で特定の細胞または組織に薬物、遺伝子、ワクチン、診断のために広範囲に採用されています。

ナノ物質薬物デリバリーシステムを考慮する際、ナノ粒子のサイズはデリバリー、吸収、分解、体からの排出に直接的に影響するため、主要な媒介変数です。例えば、直径が30nmから数百nmまでのナノ粒子は、漏出する血管構造のため腫瘍部位で受動的に蓄積でき、食細胞活動は>500nmの粒子を好む一方で、胆管では<30nm、腎臓では<8nmの粒子が蓄積されず通過します。また、肝臓は大きな粒子(200nm及び300nm)に比べて小さな粒子(25nm及び50nm)を少なく吸収します。したがって、さまざまなシステムとプロセスに応じて投与する粒子のサイズを正確に測定することが重要です。

NTA（ナノ粒子追跡分析）の薬物デリバリーシステム解析

リポソーム

リポソーム（図1）は多くの年にわたって活発に研究および開発され、現在、最も一般的な標的薬物デリバリーシステムです。リポソームは真菌性または原生動物感染のアムホテリシンB、乳がん治療のドキソルビシン、A型肝炎およびインフルエンザワクチンのデリバリーシステムとして承認されています。デリバリーシステムにおけるリポソームの使用と潜在性についての重要性はますます高まっています。その理由は明白です。

図1

• リポソームを介してデリバリーされた治療法は代謝過程中の酵素の働きから薬を保護できます。
• リポソームを使用して脂溶性物質を可溶化できます。
• リポソームに特定のリガンドを結合することで特定のエリアを標的化して治療できます。
• リポソームは細胞が容易に吸収できます。
• リポソームを選択して放出速度を制御できます。
• リポソームをデリバリーキャリアとして使用する場合、用量または頻度を減らすことができ、有毒性および副作用を減少させることができます。
• リポソームは、タンパク質、DNAなどの生物学的物質を運ぶことができます。

使用されたリポソームのサイズは、治療効果の重要な要素としてますます重要に認識されています。薬物デリバリーリポソームのサイズは、血液における循環および残存時間、標的効果、細胞吸収速度（または細胞異物吸収）などに影響し、結果的に効果的な量を成功させることができます。このようなサイズに関する考察は、すべてのナノサイズ薬物デリバリーシステムにおいて非常に重要です。

NTAを利用したリポソームサイズの測定

NanoSight装置は水およびその他の溶媒に含まれるリポソームのサイズと濃度を迅速かつ正確に測定します。

少量と最小限のサンプル前処理のみが必要です。この装置を使用すると、懸濁液中のリポソームを個別に視覚化し、そのブラウン運動を追跡して数秒以内に粒子サイズ分布を確認できます。

ナノ粒子のリアルタイム同時複数パラメーター分析

NTAはサイズおよび濃度に加えて、次のパラメーターごとの粒子情報を提供できます。

• 粒子の隣接集団を確認し、著しく異なる屈折率の物質を区別する散乱強度。
• この特有な機能により、ユーザーはリポソームのようなナノサイズの薬物デリバリーストラクチャが内容物と異なるかどうかを調査できます。つまり、空のリポソームは高屈折率の物質が含まれるリポソームよりも屈折率が（光散乱能力が）低い可能性があるため、非常に類似したサイズでも区別が可能です。
• 蛍光検出機能は複雑なバックグラウンドで適切に分類された粒子を分類することができます。NanoSightの蛍光機能は追加の適用ノートで説明します。
• NTAは、光動力学的がん治療研究においてさまざまなリポソーム研究の安定性に対する血清の効果を調査するために使用されてきました（Reshetov ほか, Photochem Photobiol. 2012年9-10月,88(5):1256-64. doi: 10.1111/j.1751-1097.2012.01176.x）。

他の薬物デリバリーシステムでのNTA利用

PBAE（ポリβ-アミノエステル）は、さまざまながんを治療するための遺伝治療のデリバリーシステムとなることができます。PBAEは組み合わせ経路を通じてDNAとのさまざまな高分子結合が可能である点で他のシステムより優れた長所を提供します。また加水分解による迅速な放出特性を持ちますが、これにより投与量の変化、生産および保管に関する問題が発生します。冷凍乾燥が一般的な保管方法であり、PBAE-DNAナノ粒子の凝集（サイズ増大）および破壊（サイズ減少）に対する冷凍乾燥の影響を評価するためにNTAが活用されました（Tzeng ほか 2011およびSunshine ほか 2012）。

PLGA（ポリ-ラクチック-コ-グリコール酸）はFDAで承認された薬物デリバリーシステムです。PLGAは乳酸およびグリコール酸に分解され、どちらも体内での代謝経路の最終点です。PLGAはアモキシシリンだけでなく進行した前立腺癌の治療のための性腺刺激ホルモン放出ホルモンの薬物デリバリーシステムとして使用されてきました。投与レベルを減らし、それに伴う毒性副作用を減少させるために免疫抑制マイコフェノール酸をPLGAにカプセル化しました。適切なデリバリーを保証し、研究者が研究間での結果を比較するための重要な媒介変数であるナノ粒子のサイズを確認するためにNTAが使用されました（Shirali ほか 2011）。

細胞膜間で分子を成功裏に移動させることがデリバリーの要です。分子だけでは細胞膜を貫通できない場合が多いため、効率的なデリバリーキャリアが必要です。Sokolova ほか 複数人（2012）は、NTA、DLS（動的光散乱）、EM（電子顕微鏡）を使用して、細胞膜間での大小の分子の多目的デリバリーキャリアとしてリン酸カルシウム（直径：100nm – 250nm、官能化により異なる）を調査しました。

オールソン ほか 複数の研究者（2012）は、リポソームの安定性と完全性を確認する目的でNTAを利用して個別のプロテオリポソームの脂質二重層膜間で100ミリ秒未満の時間の間に溶質移動に関する報告を行いました。

Ghonaimと同僚は、遺伝子デリバリーツールとしてのナノ粒子に関する研究で、リポポリアミンおよびスペルミンの化学修飾がさまざまな非ウイルスプラスミドDNAおよびsiRNAデリバリーシステムに与える影響について広範に報告しました（Ghonaim ほか, 2007a, Ghonaim ほか, 2007b, Ghonaim ほか, 2007c, Ghonaim, 2008, Ghonaim ほか, 2009, Soltan ほか, 2009, Ghonaim ほか, 2010）。同様に、Ofek ほか 複数の研究者（2010）は、siRNAデリバリーの樹状ナノデリバリーキャリアの特性解析のためにNTAを採用し、Bhise氏は細胞培養の遺伝子デリバリーポリマー研究でNTAを利用して粒子サイズとサイズ分布を測定しました（Bhise ほか, 2010）。Bhise氏は最近、高分子ナノ粒子でカプセル化されたプラスミドの数を定量化するための分析を開発する目的でこの研究を拡大し、NTAを使用して100nmナノ粒子ごとのプラスミド密度数を測定しました（Bhise ほか, 2011）。

Wei ほか 研究者（2012）はナノ薬物を開発および進化させるためにナノ粒子のサイズ、形、構成の正確な特性解析のための堅牢な方法だけでなく、非特異的な細胞毒性を低いレベルに維持し、保管中の安定性を向上させるための粒子エンジニアリングの必要性を確認しました。

NTAを利用したナノ粒子薬物デリバリーシステムのサイズ測定およびデリバリーの他の例も報告されています（Hsu ほか, 2010, Park ほか, 2010, Tagalakis ほか, 2010）。