Wie die Probenkonzentration die Peakform in OMNISEC-Daten beeinflussen kann
Es gibt viele Faktoren, die die Qualität Ihrer OMNISEC GPC/SEC-Daten beeinflussen können. Dazu gehören Dinge wie Analysemethoden, mobile Phase und Säulenkonfiguration, aber auch weniger offensichtliche Parameter wie Konzentration und Injektionsvolumen.
Ich erwähne Konzentration und Injektionsvolumen zusammen, da sie beide die Masse der in das System eingebrachten Probe beeinflussen. Eine Injektion von 100 µL einer 2 mg/mL Probe lädt dieselbe Menge an Probe wie eine Injektion von 50 µL einer 4 mg/mL Probe. Dies ist wichtig zu beachten, wenn Sie versuchen, Analysebedingungen zu optimieren, da Sie die gleiche vorbereitete Probe verwenden und einfach das Injektionsvolumen anpassen können, anstatt mehrere Proben in unterschiedlichen Konzentrationen vorzubereiten.
Was ist die ideale Konzentration für meine Probe?
Wie bei vielen Dingen mit GPC/SEC hängt die Antwort von Ihrer Probe und Ihrem System ab. Ein allgemeiner Bereich für die Probenkonzentration liegt bei 3-5 mg/mL; das ist mein Ziel, wenn ich Proben zum ersten Mal analysiere. Wenn Sie eine Säulenkonfiguration mit vielen Säulen (mehr als drei) haben, müssen Sie möglicherweise mehr Probe als erwartet injizieren, da jede Säule die Menge der Probe verdünnt, die zu einem bestimmten Zeitpunkt durch die Detektoren fließt. Wenn Sie jedoch eine Probe analysieren, von der Sie wissen, dass sie ein sehr hohes Molekulargewicht hat, müssen Sie wahrscheinlich eine niedrigere Konzentration als den vorgeschlagenen Bereich von 1-5 mg/mL verwenden.
Sie möchten genug Probe injizieren, um gute Detektorsignale zu erhalten, aber auch sicherstellen, dass Sie die Säulenkonfiguration nicht überladen, was zu ungewöhnlicher Chromatographie führen kann. Für mich lädt eine ideale Probenkonzentration die minimale Menge an Probe, die erforderlich ist, um zuverlässige Antworten in allen Detektoren zu erhalten.
Wie kann ich feststellen, ob ich die Säulenkonfiguration überlade?
Das ist eine gute Frage! Der auffälligste Hinweis ist die Form Ihres Probenpeaks.
Im Bild unten habe ich ein Multidetektor-Chromatogramm einer Probe eingefügt, das einen Probenpeak mit einer Schulter zeigt. Das allein ist nicht unbedingt ein Grund zur Besorgnis; diese Form könnte genau die Molekulargewichtsverteilung der Probe repräsentieren.
Erwarteten Sie jedoch, dass Ihre Probe eine eher gaußsche Verteilung hat, könnten Sie vermuten, dass etwas nicht ganz stimmt. Das Erste, was ich in dieser Situation tun würde, ist, die Größe jedes Peaks zu überprüfen, insbesondere das Brechungsindexsignal (RI), das direkt der Probenkonzentration entspricht.
In dem obigen Beispiel liegt die RI-Peakhöhe über 400 mV. Wie die Peakform ist dies allein nicht unbedingt ein Problem. Es weist jedoch darauf hin, dass es Raum gibt, die Probenkonzentration (oder das Injektionsvolumen) zu reduzieren, ohne dass sie nicht mehr detektierbar wird. Dies gilt auch für die anderen Detektoren.
Um festzustellen, ob die Probe die Säulenkonfiguration überlädt, wurde daher eine Verdünnungsreihe der Probe vorbereitet, um die Probe bei niedrigeren Konzentrationen zu analysieren und Änderungen in der Peakform zu überwachen.
Verdünnungsreihe
Zusätzlich zur ursprünglichen Analyse wurden drei Analysen bei niedrigeren Konzentrationen durchgeführt. Die RI-Chromatogramme dieser Injektionen sind unten überlagert.
Wie erwartet nimmt die Größe des Probenpeaks mit jeder Verdünnung ab. Mit der ersten Verdünnung ändert sich auch die Peakform – die Schulter verschwindet! Dies deutet darauf hin, dass die Konzentration der ersten Injektion für die Säulenkonfiguration zu hoch war, und als sie reduziert wurde, konnte die Probe ordnungsgemäß getrennt werden, und die erwartete gaußsche Verteilung wurde beobachtet.
Mark-Houwink-Diagramm
Um zu bestätigen, dass sich die Struktur der Probe mit der Konzentration nicht verändert, wurde das Mark-Houwink-Diagramm aller vier Injektionen untersucht, das unten gezeigt wird.
Die Mehrheit aller Diagramme überlagert sich gut, was auf eine konsistente Struktur hinweist. Die Linearität der Diagramme entspricht den Erwartungen für synthetische, lineare Polymere, bei denen das Molekulargewicht (Kettenlänge) und die Molekulargröße in konstantem Verhältnis zueinander ansteigen.
Das Diagramm der ersten Injektion mit der Schulter, in Rot dargestellt, zeigt einen Ellbogen im niedrigeren Molekulargewichtsbereich, höchstwahrscheinlich ein Ergebnis der beeinträchtigten Chromatographie.
Ideale Konzentration
Wie ich bereits sagte, denke ich, dass die ideale Konzentration die minimale Konzentration ist, die erforderlich ist, um zuverlässige Antworten in allen Detektoren zu erhalten. Das Multidetektor-Chromatogramm der letzten Injektion in der Verdünnungsreihe, unten gezeigt, liefert starke Signale für alle Detektoren ohne jegliche Schulter. Diese Konzentration beträgt etwa ein Viertel der ursprünglichen Konzentration.
Abschließende Gedanken
Abschließend hoffe ich, dass diese Untersuchung der Konzentration und ihrer Auswirkungen auf die Peakform Ihnen hilft, ein effizienterer OMNISEC-Benutzer zu werden. Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren oder mir direkt unter kyle.williams@malvernpanalytical.com zu mailen.
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