分子間相互作用解析とは?

生体内では、分子が相互作用することで様々な反応が起こります。これには生体分子同士(タンパク質とDNAなど)や、リガンド/結合パートナー(ドラッグや阻害剤など)があります。これらの反応の機能とメカニズムを理解するため、相互作用の強さを表す結合親和性評価がよく用いられます。一般的に、結合状態と解離状態が1:1に存在していることを示す解離定数(KD)が用いられ、この値が小さいほど結合親和性が高いと言えます。
 

マイクロカロリメーター ITC(等温滴定型カロリメーター)とは?

分子は相互作用するときに結合様式に応じた発熱、または吸熱反応が起こります。ITCではこの熱変化をダイレクト、かつノンラベルで測定します。得られた熱量変化から、解離定数(KD)、化学量論(結合比)(n)の他に、エンタルピー変化(∆H)およびエントロピー変化(ΔS)などの熱力学的パラメータも求められます。 これにより分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルが得られます。このように構造と機能の関係についての理解を深めることで、創薬開発におけるヒット化合物の選定とリード化合物の最適化を、より自信を持って意思決定を下すことができます。

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ITCシステム概要

ITCのサーマルコアには2つのセルがあり、そのうちの一方には水を充填し、リファレンスセルとして機能し、もう一方にはサンプルを充填します。 サンプルセルに撹拌シリンジを挿入して、相互作用する分子(リガンド)を少量ずつ滴下すると発熱または吸熱が起こります。このときに生じるリファレンスセルとサンプルセルとの温度差を限りなくゼロにするために加えられたセルヒーターのディファレンシャルパワー(DP)を測定することにより、これらの熱変化 をモニターします。


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ITCの測定原理および測定方法の詳細はこちらをご参照ください。
 

なぜITC(等温滴定型カロリメータ―)なのか?

ITCは溶液中での分子間相互作用に伴って生じた熱量変化をダイレクトに検出することで、結合親和性と熱力学的パラメータを評価できる唯一の測定技術です。タンパク質に異なる複数の結合サイトがあるような場合でも、ITCはそれぞれの結合部位に対するパラメータの定量が可能です。また、分子量の制限がありませんので、金属イオンのような小さい分子であっても測定が可能です。


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相互作用解析を実施する測定技術としては、 ELISA(酵素結合免疫吸着法)、SPR(表面プラズモン共鳴法)、MST(マイクロスケール熱泳動法)など多岐にわたります。(詳細についてはこちらをご参照ください。)

ELISAでは、相互作用で複合体を形成した分子の片方に対し結合する標識抗体の蛍光・化学発光を検出する間接的な方法であったり、SPRでは片方の分子を基板上に固定化しているため完全な溶液中でのフリーな状態での測定ではありません。その他ITCでは、mMレベルからnMレベルまでの幅広いKD範囲をカバーすると共に、詳細な結合様式の区別、化学量論(結合比)の算出といった、その他の相互作用解析では取得困難なパラメータも求められます。

これらの情報は、創薬開発における薬剤の詳細な機能評価に活用され、例えば単に結合(=作用)しやすいだけでなく、どのように結合しているのか(=特異的、非特異的)を知ることもできます。また、近年は高分子医薬品(抗体医薬品など)の品質を知る重要性も出てきており、すでに知られている化学量論と計測上との違いから、溶液中の高分子医薬品の品質把握にも用いられています。  

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さらに、創薬開発のターゲットである酵素活性評価では、ミカエリス・メンテンのメカニズムを有する酵素反応のKmおよびKcatをITCで求めることができます。一般的な酵素活性測定は標識試薬を用いることが多いですが、ITCでは酵素と基質(±阻害剤)の反応を熱量変化として検出するため、 標識が不要で、溶液中でより自然に近い測定条件下、且つリアルタイムで酵素反応をモニターできます。また、温度が制御された環境下で測定されるため、高い精度、および再現性を有しています。


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MicroCal PEAQ-ITCの特徴

弊社で取り扱っているITC(等温滴定型カロリメーター)には溶液の充填、洗浄を手動で行うマニュアルタイプ(MicroCal PEAQ-ITC)と、それらを自動で行うオートサンプラーを搭載したオートメーションタイプ(MicroCal PEAQ-ITC Automated)があります。パフォーマンス、再現性、セル容量は同等ですが、サンプル数が少ない研究施設ではマニュアルタイプのPEAQ-ITCをお勧めします。MicroCal PEAQ-ITC Automatedは多くのサンプルをスクリーニングする研究施設にお勧めします。 

どちらの装置もMicroCal PEAQ-ITCソフトウェアによって操作します。このソフトウェアには、以下の特徴がございます。
 

  • クオリティの高いデータの取得に重要な洗浄機能が向上
  • 動画にしたがって誰でも簡単に測定が可能
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  • シミュレーションによる実験デザイン・妥当性評価・最適化がより便利に
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MicroCal PEAQ-ITC

MicroCal PEAQ-ITC

すべての結合パラメータを高感度で測定。

詳細
測定 ラベルフリー解析, 結合親和性
測定温度範囲 2°C - 80°C
サンプル処理 8 per 8h day - 12per 8h day
技術 等温滴定型カロリメトリー(ITC)

MicroCal PEAQ-ITC Automated

MicroCal PEAQ-ITC Automated

結合に関する様々なパラメータを高い生産性で測定可能

詳細
測定 ラベルフリー解析, 結合親和性
測定温度範囲 2°C - 80°C
サンプル処理 x per 24h day - 42per 24h day
技術 等温滴定型カロリメトリー(ITC)

MicroCal PEAQ-ITC

MicroCal PEAQ-ITC

すべての結合パラメータを高感度で測定。

MicroCal PEAQ-ITC Automated

MicroCal PEAQ-ITC Automated

結合に関する様々なパラメータを高い生産性で測定可能

詳細 詳細
測定 ラベルフリー解析, 結合親和性 ラベルフリー解析, 結合親和性
測定温度範囲 2°C - 80°C 2°C - 80°C
サンプル処理 8 per 8h day - 12per 8h day x per 24h day - 42per 24h day
技術 等温滴定型カロリメトリー(ITC) 等温滴定型カロリメトリー(ITC)

MicroCal PEAQ-ITC

MicroCal PEAQ-ITC Automated

MicroCal PEAQ-ITC MicroCal PEAQ-ITC Automated

すべての結合パラメータを高感度で測定。

結合に関する様々なパラメータを高い生産性で測定可能

詳細 詳細
測定タイプ
ラベルフリー解析
結合親和性
技術
等温滴定型カロリメトリー(ITC)
サンプル処理 8 per 8h day - 12per 8h day x per 24h day - 42per 24h day