結合親和性を理解することは、生物学的過程、構造生物学、および構造と機能の関係を促進する分子間相互作用の評価にとって重要です。創薬過程の一部としても測定され、選択的および特異的にターゲットに結合するドラッグデザインに役立ちます。
結合親和性とは何ですか?
結合親和性は、単一の生体分子(タンパク質やDNAなど)とリガンド/結合パートナー(ドラッグや阻害剤など)との結合相互作用の強さです。結合親和性の一般的な測定とレポートは平衡解離定数(KD)によって行われます。これは、生体分子の相互作用の強さの評価とランク付けに使用されます。KD値が小さいほど、ターゲットに対するリガンドの結合親和性が大きくなります。KD値が大きいほど、ターゲット分子とリガンドが互いに引き合い、結合する力が弱くなります。
結合親和性は、水素結合、静電気的相互作用、2分子間の疎水性およびファンデルワールス力など、非共有分子間相互作用の影響を受けます。また、リガンドとターゲット分子の結合親和性は、他の分子の存在に影響を受ける可能性があります。
用途の結合親和性を測定する必要があるのはなぜですか。
タンパク質、核酸、およびあらゆる生体分子の特性評価を行う場合は、基質、阻害剤、および補助因子への結合親和性を理解することが、酵素反応、タンパク質複合体、または受容体結合などの研究に関連する分子間相互作用の評価にとって重要です。創薬の場合、結合親和性は選択的かつ特異的にターゲットに結合する薬剤の設計に役立ちます。
結合を測定する方法は多数あります。ELISAやゲルシフトアッセイなどの定性的手法(結合性:あり/なし)と、分光評価、光学バイオセンサー(GCIなど)、等温滴定型カロリメトリーなどの定量的手法(結合親和性)です。
Methods for measuring binding affinity
結合親和性を測定するには、相互作用因子の標識を必要とする方法や標識を使用しないアプローチなど、多くの方法があります。主な標識定性法 (結合: はい/いいえ) は酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) です。主要なラベルフリーの定量法には、分光アッセイ、等温滴定熱量測定 (ITC)、または表面プラズモン共鳴 (SPR)、生体層干渉法 (BLI)、回折格子結合干渉法 (GCI) などの光学バイオセンサーが含まれます。
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- 酵素免疫測定法 (ELISA)
- ELISA は、固定化リガンドを使用して溶液から標的分析物を捕捉し、特殊な検出試薬 (ラベル) を使用して 2 つの分子間の反応を分析するプレートベースのアッセイ技術です。
- 表面プラズモン共鳴 (SPR)
- SPR は、表面プラズモンの局在エバネッセント場内での屈折率変化として分子相互作用を検出する、ラベルフリーの光学センシング技術です。マイクロ流体チャネルにより、より正確な測定が可能になります。
- 生物層干渉法 (BLI)
- BLI は、光学バイオセンサーを使用して、バイオセンサー チップから反射された光の干渉パターンの変化を測定します。バイオセンサーチップは通常、捕捉分子でコーティングされ、対象の分析物を含むサンプル溶液に浸されます。 BLI はラベルフリーです。
- 回折格子結合干渉計 (GCI)
- GCI は、サンプルと参照ビームを光ファイバー導波路に結合するラベルフリーの光学センシング技術です。結合親和性と反応速度は、相互作用から生じる時間依存の位相シフト信号を測定することによって分析されます。
- 等温滴定熱量測定 (ITC)
- ITC は、結合相互作用に関連する熱変化を測定し、結合の化学量論と熱力学を決定します。
結合親和性の評価
Kinetics Guide - Binding kinetics with the WAVEsystem
どのような方法で結合親和性を測定しても、測定結果は複数のレポート ポイントとなり、そこから結合親和性曲線を作成できます。この曲線は、サンプルの濃度と、サンプルとターゲット間の相互作用の両方に依存します。
このため、定期的な適切な実験コントロールに加えて、サンプルの濃度を知り、適切なインキュベーション期間を考慮することが重要になります。アッセイ中に平衡状態(ターゲットに結合する分子の量がターゲットから解離する量と同じ)に達することが特に重要です。平衡に達しないと結合モデルを確実に適合させることができないため、親和性を確実に決定することはできません。
詳細については、動力学ガイドをご覧ください。
Malvern Panalyticalには、どのような結合親和性ソリューションがありますか?
Malvern Panalyticalは、グレーティング結合干渉法(GCI)と等温滴定型カロリメトリー(ITC)の両方を提供しています。どちらの手法もラベルフリーであり、天然分子を使用できます。広範な相互作用について、高度に定量的な親和性(KD値)が両方から得られます。
GCIは、結合イベントによって発生するエバネッセント場の屈折率の変化を測定する光学的手法であり、相互作用の親和性と動力学の研究に使用されます。GCIでは、mMからpMの範囲でKD値を測定し、さらに相互作用の動力学を決定します。具体的には、オン(ka)およびオフ(kd)の速度を決定します。
ITCは、結合イベントに関連する熱変化を測定します。ITCではKD値をmMからnMの範囲で測定し、相互作用の結合比と結合熱力学も決定します。分子間相互作用の特性評価では、動力学と熱力学の両方が重要です。
グレーティング結合干渉法(GCI)
等温滴定型カロリメトリー(ITC)
ラベルフリー相互作用解析
GCIやITCは用途に最適ですか?
両方の装置から得られる親和性は直交しているため、特にリード分子の最適化用途で高度に定量的なKDが必要な場合に、信頼性を高めることができます。
GCIは、感度とスループットが高く、サンプル消費量が少ないため、粗製サンプルでも良好に動作します。これらの因子と動力学的情報が用途にとって最も重要である場合は、これが明らかに最適な装置です。
熱力学データ(エンタルピーとエントロピー)と結合比が最も重要な場合は、ITCが最適なソリューションです。また、ITCはアッセイ開発を最小限に抑えることができるため、特定の相互作用ペアの予測測定数が少ない場合は、迅速に結果が得られます。また、この手法は非破壊で、サンプルは実験後に回収できます。
WAVEsystem (GCI)と MicroCal PEAQ-ITC は、どちらもユーザーを念頭に置いて設計されていて、それぞれの装置クラスで使いやすさに定評があります。