示差走査蛍光定量法（DSF）
タンパク質の安定性、製剤化、生体分子間相互作用に関する迅速な知見
タンパク質の安定性、製剤化、生体分子間相互作用に関する迅速な知見
示差走査蛍光定量法（DSF）は、試料に制御された熱ストレスを加え、その際の蛍光変化を追跡することで、タンパク質の構造安定性を評価する迅速な生物物理学的手法です。温度が上昇すると、熱エネルギーがタンパク質の本来の三次元構造を破壊し、これまで疎水性コア内に隠れていた内部領域が露出します。
従来の外因性DSFでは、新たに露出した疎水性領域に結合する外部レポーター色素を用いて、この構造的アンフォールディングを検出します。ラベルフリーの内在性DSFは、タンパク質中のトリプトファンなどの芳香族アミノ酸の自然蛍光を利用しています。試料がほどけるにつれ、芳香族アミノ酸は埋没した非極性環境から露出した極性環境へと移行し、これによりタンパク質の自然蛍光発光スペクトルに変化が生じます。
内在性示差走査蛍光定量法は、280 nmの紫外線を吸収し、300 nm～400 nmの範囲で蛍光を発するアミノ酸トリプトファンを利用しています。
天然の折りたたまれたタンパク質では、トリプトファン残基は通常、疎水性コアに存在し、約330 nmの波長で発光します。熱ストレスによってタンパク質がほどけると、埋没残基が周囲の極性水性環境にさらされ、発光スペクトルが350 nm方向にシフトします。
このシステムは、制御された昇温過程において、2つの発光波長（F350/F330）の比率を記録し、シグモイド型の熱変性曲線を描画します。この曲線の数学的解析により、アンフォールディングの開始点（Ton）と、タンパク質集団の50%がアンフォールディングした状態になる融解中間温度（Tm）を特定できます。
Tm値が高いほど熱変性への耐性が強くなるため、DSFは候補分子を迅速に評価し、バッファ条件をスクリーニングし、創薬パイプライン全体で候補物質の安定性を検証するのに役立ちます。
さらに、静的光散乱や動的光散乱などの光散乱法と組み合わせることで、内在性DSFはタンパク質の構造的アンフォールディングと物理的凝集を区別し、溶液中のタンパク質の包括的な安定性プロファイルを提供することができます。
示差走査蛍光定量法（DSF）は、温度上昇に伴うタンパク質の構造変化を観察することで、タンパク質の熱安定性を測定します。外因性DSFと内在性DSFの違いは、レポーター色素が添加されているかどうかにあります。
| 機能 | 外因性DSF | 内在性DSF |
|---|---|---|
| メカニズム | アンフォールディング過程で露出した疎水性領域に結合する蛍光色素（SYPRO Orangeなど）を追加して使用します。 | 芳香族アミノ酸（トリプトファン/チロシン）の自然蛍光の変化を記録するラベルフリー技術。 |
| 試料調製 | 色素の添加と最適化が必要です。 | ラベルフリー技術により、タンパク質をその天然の緩衝液中で測定できます。 |
外因性DSFの制約：
内在性DSFの制約：
次世代の生物物理学的大規模スクリーニング
